史曉霞，張寶會，姚新轉(zhuǎn)，呂立堂，

1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州貴陽 550025

過氧化物酶廣泛存在于生物體內(nèi)，可催化作為電子受體的過氧化氫和多種電子供體之間的氧化還原反應(yīng)［1-2］。根據(jù)蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征，過氧化物酶分為血紅素過氧化物酶和非血紅素過氧化物酶，前者主要分為動物類和非動物類血紅素過氧化物酶［3］，非動物類血紅素過氧化物酶又可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類［4］。Ⅲ類過氧化物酶（class Ⅲperoxidases，POD）是植物中一種特殊的氧化還原酶，是一種分泌型過氧化物酶，參與植物體內(nèi)多種不同的生理過程，如植物防御、細胞壁合成、組織愈傷、植物體內(nèi)毒性過氧化物的清除等［2-7］。研究表明，POD（也稱POX、Prx、Px 或PER）家族成員參與多種植物的生物學(xué)過程，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtPrx64 基因過表達可增強轉(zhuǎn)基因煙草植株對鋁脅迫的耐受性［8］，AtPRX3 基因?qū)χ参锟购岛涂果}脅迫具有正向的調(diào)節(jié)作用［6］，AtPrx72基因?qū)θ~片木質(zhì)化有重要影響［9］，且POD 基因（At-Prx22，AtPrx39 和AtPrx69）過表達會提高擬南芥的耐寒性［10］；蘿卜（Raphanus sativus）中，抑制過氧化物酶基因rspral 的表達可發(fā)揮抗鹽、抗氧化和抗高溫功能［11］；棉花（Gossypium hirsutum）中GhPOX1 基因具有較高活性氧水平［12］，表明GhPOX1 可能通過介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生從而影響細胞生長的過程。

目前，對POD 基因家族在茶樹逆境生長中作用的相關(guān)研究鮮有報道，因此，本研究在擬南芥全基因組水平上，通過生物信息學(xué)方法鑒別茶樹POD 基因家族成員，并對其理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體定位、共線性、基序組成和基因結(jié)構(gòu)及在逆境下的表達模式進行系統(tǒng)分析，探討植物中POD 蛋白序列的進化聯(lián)系，以期為POD 基因家族的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 茶樹POD 基因家族的篩選及相應(yīng)蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測 根據(jù)已報道的擬南芥POD 基因家族信息，從擬南芥信息庫（https: ／ ／ www.arabidopsis.org ／）中下載其氨基酸序列，應(yīng)用Tbtools 軟件（https:／／github.com ／ CJ-Chen ／ TBtools ／ releases）將下載的序列與茶樹基因組數(shù)據(jù)庫進行BLASTP 比對（e ＜1e-5），初步獲得假設(shè)的茶樹POD 基因，構(gòu)建關(guān)于茶樹POD 基因的隱馬爾可夫模型，進行第二次搜索鑒定，再次獲得假設(shè)的茶樹POD 基因。將第二次搜索獲得的茶樹POD 基因蛋白序列提交至NCBI-CDD（https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov ／ Structure ／ cdd ／ wrpsb.cgi）、SMART（http:／／smart.embl-heidelberg.de／）及Pfam（http:／／pfam.xfam.org ／）系統(tǒng)進行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，剔除冗余序列，最終獲得茶樹POD 基因序列用于后續(xù)分析。利用在線軟件ExPASy-ProParam（https: ／／ web.expasy.org ／compute_pi ／）分析茶樹POD 基因家族成員蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及等電點等理化性質(zhì)。

1. 2 茶樹POD 基因家族染色體定位分析 根據(jù)Phytozome 12. 0 茶樹數(shù)據(jù)庫中的BLASTN 結(jié)果，將茶樹POD 基因定位至不同的染色體上。

1. 3 系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析采用MEGA X 軟件中近鄰連接法（Boostrap 為1 000）構(gòu)建茶樹POD 蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹。將茶樹POD基因組DNA 序列和CDS 序列提交至GSDS 2. 0（http: ／ ／ gsds.cbi.pku.edu.cn ／）進行基因結(jié)構(gòu)分析，通過MEME（http: ／ ／ meme-suite.org ／）進行保守結(jié)構(gòu)域分析，motif 數(shù)目設(shè)置為15 個，其他均為默認，并利用軟件Tbtools 進行作圖。

1. 4 擬南芥、葡萄和茶樹POD 基因家族的進化分析應(yīng)用ClustalW 對下載的擬南芥、葡萄和茶樹的POD基因蛋白序列進行多序列比對，采用MEGA10. 0 的臨近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建進化樹，Boostrap 參數(shù)設(shè)為1 000。

1. 5 茶樹POD 基因家族種內(nèi)及種間共線性分析利用MCScanX 程序?qū)M南芥、葡萄和茶樹基因組信息進行比對，并通過TBtools 軟件分析共線性及基因復(fù)制區(qū)塊。應(yīng)用DnaSP 5. 0 軟件計算非同義替換（Ka）和同義替換（Ks）值［13］，剔除同義替換率（Ks）＞2. 0 的數(shù)值，以避免替代飽和風(fēng)險。

1. 6 表達模式分析 根據(jù)鑒定出的茶樹POD 基因的編號，在TPIA（http: ／ ／ tpia.teaplant.org）數(shù)據(jù)庫上下載其在茶樹不同組織（包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、果實、莖、根）中及經(jīng)鹽脅迫（0、24、48、72 h）、PEG 誘導(dǎo)的干旱脅迫（0、24、48、72 h）與冷脅迫［非馴化（平均溫度10 ℃以下）→完全馴化（平均溫度達10 ℃以上）→去馴化］后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（TPM 值），對表達數(shù)據(jù)進行分析并采用TBtools 軟件制作熱圖。

2 結(jié) 果

2. 1 茶樹POD 基因家族成員鑒定及其相應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測 經(jīng)BLASTP 比對共獲得122 個茶樹POD 基因。最長的POD 蛋白（CSSPOD90）含有398個氨基酸殘基，最短的（CSSPOD111）含有142 個氨基酸殘基；相對分子質(zhì)量最大為43 700（CSSPOD90），最小為15 300（CSSPOD111）；理論等電點（pI）介于4.62（CSSPOD22）～9. 74（CSSPOD67）之間。pI ＜7 的POD 蛋白達48%（59 個），表明茶樹POD 蛋白家族一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸。

2. 2 茶樹POD 基因家族染色體定位分析 獲得122 個茶樹POD 基因中，CSSPOD11、CSSPOD95、CSSPOD68、CSSPOD24、CSSPOD86、CSSPOD28、CSSPOD108、CSSPOD111、CSSPOD102、CSSPOD62、CSSPOD72、CSSPOD75、CSSPOD93、CSSPOD43、CSSPOD85、CSSPOD94、CSSPOD110、CSSPOD70、CSSPOD67、CSSPOD107、CSSPOD112、CSSPOD2、CSSPOD77、CSSPOD38 共24 個基因不能定位至染色體上，其他98 個基因不均等定位至不同染色體上，其中4 和13 號染色體包含基因個數(shù)最多，有12 個茶樹POD 基因；14 號染色體不含茶樹POD 基因，極有可能發(fā)生了高度變異。另外，茶樹POD 基因家族存在較多的串聯(lián)重復(fù)基因序列，其中在Chr1、Chr4、Chr7、Chr12、Chr13 染色體上均有2 個，表明這些基因在茶樹POD 基因家族的擴張和進化中扮演著重要角色。見圖1。

圖1 茶樹POD 基因家族成員的染色體定位Fig. 1 Chromosome location of members of POD gene family in C. sinensis（L.）

2. 3 系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析 共鑒定出10 個茶樹POD 基因家族成員的保守基序，依次命名為基序1 ～10。親緣關(guān)系越近的成員其基序結(jié)構(gòu)相似度越高；保守基序8 在所有茶樹POD 基因家族成員中均有出現(xiàn)，且各亞組所包含的保守基序基本一致，因此該家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。茶樹POD 基因家族有113 個基因含有2 個外顯子（最少），推測其功能具有高度保守性，另外9 個基因含有3 ～4 個外顯子，其結(jié)構(gòu)可能更為復(fù)雜。見圖2。

圖2 茶樹POD 基因的系統(tǒng)進化圖（A）、保守基序的示意圖（B）及基本基因結(jié)構(gòu)圖（C）Fig. 2 Phylogenetic relationships（A）, schematic diagram of conserved POD protein motif（B）and basic structure（C）of POD genes in C.sinensis（L.）

2. 4 擬南芥、葡萄與茶樹POD 基因家族的進化分析擬南芥、葡萄和茶樹POD 基因家族分為5 個簇，其中，簇4 的POD 基因最多，包含49 個茶樹POD 基因、27個擬南芥POD 基因和21 個葡萄POD 基因；簇1 的POD 基因最少，包含18 個茶樹POD 基因、4 個擬南芥POD 基因和2 個葡萄POD 基因。系統(tǒng)發(fā)育樹還表明，茶樹POD 家族基因與擬南芥、葡萄POD 家族基因有相對親緣關(guān)系。

2. 5 茶樹POD 基因家族種內(nèi)及種間共線性分析122 個茶樹POD 基因家族成員中，存在23 對共線性關(guān)系，Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr6 上的茶樹POD 基因家族成員共線性較多，Chr7、Chr9、Chr10、Chr11、Chr15 上的茶樹POD 基因家族成員共線性較少。擬南芥和茶樹POD 基因間有10 對共線性關(guān)系，葡萄和茶樹POD 基因間有32 對共線性關(guān)系，表明這些POD基因?qū)赡軄碜怨餐淖嫦龋哂邢嗤墓δ?。另外，葡萄和茶樹POD 基因家族具有高度的保守性，在進化過程中發(fā)揮重要作用。

2. 6 Ka／Ks 分析 在122 個茶樹POD 基因家族成員中篩選出23 對基因進行Ka ／ Ks 分析，23 個基因?qū)Φ腒a ／Ks 值均＜1，見表1。表明這些基因經(jīng)過較強的純化選擇，復(fù)制方式均為全基因組復(fù)制或片段復(fù)制，在進化中較為保守，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，功能具有一致性。

表1 茶樹POD 基因家族的Ka ／ Ks 分析Tab. 1 Ka ／ Ks analysis of POD family genes in C. sinensis（L.）

2. 7 茶樹POD 基因家族成員在茶樹不同組織中的表達分析 CSSPOD94、CSSPOD43、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD48、CSSPOD51、CSSPOD115、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD-93、CSSPOD97、CSSPOD68、CSSPOD63 共15 個基因在茶樹所有組織中表達量較高，表明這些基因?qū)Σ枭L發(fā)育具有重要作用；CSSPOD66、CSSPOD73、CSSPOD116、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD61、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59 在所有組織中均呈微弱表達；相對其他組織比較，CSSPOD120、CSSPOD121 在果實中的表達水平總體較高，CSSPO-D43、CSSPOD48、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD36、CSSPOD88、CSSPOD90 在花中的表達水平總體較高；CSSPOD116、CSSPOD118、CSSPOD119 的表達量隨著葉片成熟度的增加逐漸上調(diào)，CSSPOD94、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達量隨著葉片成熟度的增加逐漸下調(diào)，而CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD155、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70 的表達量隨著葉片成熟度的增加呈先上升后下降的趨勢。上述結(jié)果表明，不同茶樹POD 基因可能參與茶樹的不同生長發(fā)育過程。

2. 8 茶樹POD 基因家族成員在干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫條件下的表達模式 在干旱脅迫下，與其他基因的表達水平比較，CSSPOD116、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD115、CSSPOD-50、CSSPOD51 的表達量較高；CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD73、CSSPOD93、CSSPOD97、CSSPOD94 的表達量受到抑制，其中CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD73 的表達水平在48 h 時上調(diào)；CSSPOD44、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59、CSSPOD69、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD36、CSSPOD-52 的表達水平呈上調(diào)趨勢；CSSPOD10、CSSPOD11、CSSPOD65、CSSPOD88 等基因不受干旱脅迫處理的調(diào)控。在鹽脅迫處理下，CSSPOD94、CSSPOD115、CSSPOD116、CSSPOD46、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達受到抑制，CSSPOD40、CSSPOD36、CSSPOD44、CSSPOD78、CSSPOD57、CSSPOD59、CSSPOD69、CSSPOD118、CSSPOD119、CSSPOD52 的表達水平呈上升趨勢，CSSPOD10、CSSPOD11、CSSPOD28、CSSPOD29 等基因不受鹽脅迫的調(diào)控。在冷處理下，CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD50、CSSPOD51、CSSPOD67、CSSPOD60 基因的表達量在CA1 明顯上調(diào)，CSSPOD43、CSSPOD48、CSSPOD93、CSSPOD97 的表達量在CA3 明顯上調(diào)，但大部分基因不受冷脅迫的影響。上述結(jié)果表明，鹽脅迫增加了茶樹大多數(shù)POD 表達，干旱脅迫則降低了其表達，茶樹在對抗非生物脅迫時POD 基因家族起著重要作用。

3 討 論

已在多個物種中鑒定出POD 基因家族成員，其中包括擬南芥［14］、水稻［15］、葡萄［20］、毛果楊［16］等，目前，尚無對茶樹中的POD 基因家族生物信息學(xué)分析的相關(guān)報道。本實驗在全基因組水平一共鑒定出122 個茶樹POD 基因，全面分析了茶樹POD 基因家族的基本理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基序組成和基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系、組織特異性及非生物脅迫響應(yīng)。檢測結(jié)果表明，89%（109 ／ 122）的茶樹POD 的相對分子質(zhì)量在30 000 ～45 000 范圍內(nèi)，該結(jié)果與相關(guān)的研究結(jié)果相符［2，17］；pI 介于4. 62 ～9. 74之間，茶樹POD 蛋白家族一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸。茶樹中的大多數(shù)POD 基因（113 ／122）均帶有1 個以上的外顯子，這與梨PbPRX（90 ／94）和玉米ZmPRX（89 ／ 91）中POD 基因中外顯子的比例相似［18-19］。通過比較分析，確定了擬南芥、葡萄和茶樹POD 基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹分成5 個簇，簇4 的POD 基因最多，簇1 的POD 基因最少?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，所有茶樹POD蛋白均具有典型的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，保守基序8在所有茶樹POD 中均有呈現(xiàn)，推測其在植物防御過程中起作用［20］，除1 個亞組外，其他各亞組所包含的保守基序基本一致，因此該家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。另外，茶樹POD 基因在不同亞基因組中數(shù)量不同，表明POD 基因在茶樹進化過程中發(fā)生了基因保留和丟失。共線性分析結(jié)果表明，擬南芥、葡萄和茶樹POD 基因在進化上具有近緣關(guān)系。在進化過程中，基因通常會受到各種選擇壓力，如純化選擇（Ka ／ Ks ＜1），陽性選擇（Ka ／ Ks ＞1）和中性選擇（Ka ／ Ks = 1）［21］，茶樹POD 基因組中23 個基因?qū)Φ腒a ／ Ks 值均＜1，表明這些基因經(jīng)過較強的純化選擇，在進化中較為保守。

植物體內(nèi)POD 含量增加可抑制過氧化氫的產(chǎn)生和活性氧的形成，通過這種抑制作用增強植物對脅迫的抗性，如擬南芥AtPRX3 基因?qū)χ参锟购岛涂果}脅迫具有正向的調(diào)節(jié)作用［6］，蘿卜中過氧化物酶基因rspral 在抑制表達條件下具有抗鹽、抗氧化和抗高溫功能［11］，煙草中過表達長春花過氧化物酶基因CrPrx 和CrPrx1 分別增強了耐寒性和發(fā)芽率［22］。本研究表達模式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹POD 基因具有組織特異性，CSSPOD94、CSSPOD43、CSSPOD46、CSSPOD50、CSSPOD48、CSSPOD51、CSSPOD115、CSSPOD120、CSSPOD121、CSSPOD67、CSSPOD70、CSSPOD93、CSSPOD97、CSSPOD68、CSSPOD63 等15 個基因在茶樹所有組織中均有表達，且具有較高的表達量，表明這些基因在功能上具有多樣化，在抵抗脅迫方面具有積極作用。

研究表明，POD 涉及廣泛的生理過程，如植物防御過程、細胞壁合成、組織愈傷、植物體內(nèi)活性氧清除等。本研究結(jié)果表明，茶樹POD 基因家族在脅迫響應(yīng)與生長發(fā)育過程中可能參與重要的調(diào)控作用，為進一步分析茶樹POD 基因家族在生物或非生物脅迫及其生長發(fā)育中的功能和作用奠定了基礎(chǔ)。志謝感謝貴州大學(xué)茶學(xué)院呂立堂老師對本論文的指導(dǎo)及貴州大學(xué)茶學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院的授課老師及同學(xué)對本文的幫助