王文偉，何成，王蓓，樓覺(jué)人，

1. 上海至成生物科技有限公司，上海 200051；2. 上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海 200051

等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）是蛋白質(zhì)的一種物理化學(xué)屬性，在一定的pH 條件下，蛋白質(zhì)的氨基酸分子所帶的正、負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此時(shí)的pH 稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的pI［1］。pI 的測(cè)定能夠反映蛋白藥物的電荷異質(zhì)性，廣泛應(yīng)用于重組蛋白藥物的質(zhì)量評(píng)價(jià)，是重組蛋白藥物質(zhì)量控制的一個(gè)重要手段［2-4］。

等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳是測(cè)定蛋白質(zhì)pI 的常用方法，包括凝膠等電聚焦（gelbased isoelectric focusing，gIEF）電泳、毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）電泳和全柱成像毛細(xì)管等電聚焦（whole column imaging detectioncapillary isoelectric focusing，WCID-CIEF）電泳。IEF 的基本原理是：兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)下形成一個(gè)pH 梯度，當(dāng)待測(cè)樣品遷移至某一pH 位置時(shí)，其所帶的凈電荷為零，不再移動(dòng)，則該處的pH 值即為樣品的pI［5-6］。gIEF 所能分離的分子量范圍較小，分辨率低，準(zhǔn)確度差，無(wú)法滿(mǎn)足重組病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）等生物大分子pI 的測(cè)定。傳統(tǒng)的CIEF 在聚焦完成后，需將樣品區(qū)帶遷移至檢測(cè)窗口，在遷移過(guò)程中易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或沉淀，譜帶展寬，從而影響分離度和分辨率。WCID-CIEF 克服了傳統(tǒng)CIEF 的不足，聚焦完成后無(wú)需進(jìn)行樣品遷移，聚焦和檢測(cè)能夠同步完成，廣泛應(yīng)用于重組蛋白藥物pI 的測(cè)定和電荷異質(zhì)性的分析［7-10］。

重組人腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）VLPs由病毒的衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3 組裝而成，直徑約30 nm［11-12］，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大（約5 660 000），目前鮮有對(duì)重組EV71 VLPs pI 研究的報(bào)道。本研究旨在建立重組人EV71 VLPs pI WCID-CIEF 測(cè)定方法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1. 1 樣品 重組人EV71 VLPs 采用巴斯德畢赤酵母表達(dá)，由上海至成生物科技有限公司制備。

1. 2 主要試劑及儀器 兩性電解質(zhì)Pharmalyte pH 3-10 購(gòu)自美國(guó)GE 公司；尿素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0. 5%甲基纖維素、1%甲基纖維素、陰陽(yáng)極電解液、pI marker（4.05、5.85、7.05 和8. 40）、Maurice CIEF 毛細(xì)管卡盒和Maurice 毛細(xì)管電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Protein simple 公司。

1. 3 樣品處理 重組人EV71 VLPs 經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，用雙蒸水稀釋5 倍。取兩性電解質(zhì)Pharmalyte pH3-10 4 μL，1%甲基纖維素35 μL，4. 05 和8. 40 的pI marker 各1 μL，雙蒸水39 μL，稀釋后的EV71 VLPs 20 μL，置渦旋混勻器中充分混合均勻，1 000 × g 離心5 min，吸取90 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔樣品板中，蓋上蓋板，4 ℃，1 000 × g 離心5 min。

1. 4 WCID-CIEF 采用預(yù)制Maurice CIEF 毛細(xì)管卡盒，卡盒內(nèi)的毛細(xì)管內(nèi)壁為氟碳涂層，內(nèi)徑100 μm，有效長(zhǎng)度5 cm。陽(yáng)極液為含0. 1%甲基纖維素的80 mmol ／ L 磷酸，陰極液為含0. 1%甲基纖維素的100 mmol ／ L 氫氧化鈉，待測(cè)樣品采用真空進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為55 s。毛細(xì)管等電聚焦過(guò)程參數(shù)設(shè)置為：1 500 V 預(yù)聚焦1 min，3 000 V 聚焦5 min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1. 5 聚焦時(shí)間的優(yōu)化 按照1.4 項(xiàng)進(jìn)行WCID-CIEF，聚焦過(guò)程中Maurice 電泳儀會(huì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每隔10 s 采集1 次數(shù)據(jù)，比較不同聚焦時(shí)間下重組人EV71 VLPs 的聚焦效果，選擇合適的聚焦時(shí)間。

1. 6 尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs 分離效果影響的檢測(cè) 樣品混合液中添加8 mol ／ L 尿素，設(shè)置終濃度為0、1、2 mol ／ L 3 個(gè)尿素濃度梯度，按照1. 4 項(xiàng)分別進(jìn)行WCID-CIEF，比較不同尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs 分離效果的影響。

1. 7 方法的驗(yàn)證

1. 7. 1 專(zhuān)屬性 將空白制劑組分（空白緩沖液）和重組人EV71 VLPs 分別作為待測(cè)樣品，按照1. 4 項(xiàng)分別進(jìn)行WCID-CIEF。

1. 7. 2 準(zhǔn)確度 將pI marker 5.85 和pI marker 7.05分別作為待測(cè)樣品，按照1.4 項(xiàng)分別進(jìn)行WCID-CIEF，測(cè)定pI marker 的pI，每個(gè)pI marker 重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算6 次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）及6 次結(jié)果的平均值與理論值的相對(duì)偏差。

RSD（%）= 測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差／ 測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值× 100%；

平均值與理論值的相對(duì)偏差=|測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值-理論值| ／ 理論值× 100%

1. 7. 3 重復(fù)性 將重組人EV71 VLPs 作為待測(cè)樣品，按照1. 4 項(xiàng)進(jìn)行WCID-CIEF，測(cè)定EV71 VLPs的pI，重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算6 次結(jié)果的RSD。

1. 7. 4 中間精密度 將重組人EV71 VLPs 作為待測(cè)樣品，在不同日期，由不同實(shí)驗(yàn)人員按照1. 4 項(xiàng)進(jìn)行WCID-CIEF，測(cè)定EV71 VLPs 的pI，分別重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算12 次結(jié)果的RSD。

2 結(jié) 果

2. 1 聚焦時(shí)間的優(yōu)化 3 000 V 聚焦1 min，重組人EV71 VLPs、pI marker 4. 05 和pI marker 8. 40 均未完成聚焦；3 000 V 聚焦2 min，pI marker 4. 05 聚焦完成；3 000 V 聚焦3 min，pI marker 8. 40 聚焦完成；3 000 V 聚焦4 ～5 min，圖譜不再變化，表明重組人EV71 VLPs 聚焦完成。見(jiàn)圖1。選擇3 000 V聚焦5 min 作為后續(xù)試驗(yàn)的聚焦條件。

圖1 聚焦時(shí)間對(duì)重組人EV71 VLPs 分離效果的影響Fig. 1 Effect of focusing time on separation of recombinant human EV71 VLPs

2. 2 尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs 聚焦效果的影響 在0、1、2 mol ／ L 3 個(gè)尿素濃度條件下，重組人EV71 VLPs 的等電聚焦圖譜基本一致，表明尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs 的分離效果影響不大，見(jiàn)圖2。因此選擇重組人EV71 VLPs 樣品處理時(shí)不添加尿素。

圖2 尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs 分離效果的影響Fig. 2 Effect of urea concentration on separation of recombinant human EV71 VLPs

2. 3 方法的驗(yàn)證

2. 3. 1 專(zhuān)屬性 空白制劑組分在pI marker 4. 05和pI marker 8. 40 之間無(wú)紫外吸收峰，而重組人EV71 VLPs 有特異紫外吸收峰，表明空白緩沖液對(duì)重組人EV71 VLPs pI 的測(cè)定無(wú)干擾，方法的專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖3。

圖3 方法的專(zhuān)屬性驗(yàn)證Fig. 3 Verification for specificity of WCID-CIEF electrophoresis

2. 3. 2 準(zhǔn)確度 pI marker 5. 85 作為待測(cè)樣品，6次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值為5. 81，RSD 為0. 18%，6 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值與理論值的相對(duì)偏差為0. 63%；pI marker 7. 05 作為待測(cè)樣品，6 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值為7. 16，RSD 為0. 06%，6 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值與理論值的相對(duì)偏差為1. 54%。表明方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

表1 方法的準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果（pI）Tab.1 Verification for accuracy of WCID-CIEF electrophoresis（pI）

2. 3. 3 重復(fù)性 重組人EV71 VLPs pI 6 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值為6. 47，RSD 為0. 08%，表明方法的重復(fù)性良好，見(jiàn)表2。

表2 方法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab. 2 Verification for reproducibility of WCID-CIEF electrophoresis

2. 3. 4 中間精密度 不同實(shí)驗(yàn)人員在不同日期對(duì)重組人EV71 VLPs pI 12 次重復(fù)測(cè)定的平均值為6. 46，RSD 為0. 14%，表明方法的中間精密度良好，見(jiàn)表3。

表3 方法的中間精密度驗(yàn)證結(jié)果（pI）Tab. 3 Verification for intermediate precision of WCID-CIEF electrophoresis（pI）

3 討 論

WCID-CIEF 是20 世紀(jì)90 年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，其將成像技術(shù)和CIEF 結(jié)合在一起，通過(guò)基于電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary metal-oxidesemiconductor，CMOS）的成像裝置對(duì)整個(gè)毛細(xì)管柱內(nèi)的分離過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤成像［13］，可實(shí)時(shí)觀察樣品的等電聚焦過(guò)程，整個(gè)過(guò)程中無(wú)需進(jìn)行樣品遷移，一次檢測(cè)即可完成對(duì)樣品聚焦時(shí)間的優(yōu)化，大大節(jié)約了方法開(kāi)發(fā)所需時(shí)間。由于省略了復(fù)雜的樣品遷移過(guò)程，WCID-CIEF 與傳統(tǒng)的CIEF 相比，具有分析時(shí)間短（通常＜10 min）、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，尤其適合重組蛋白等復(fù)雜的生物大分子藥物pI 的精確測(cè)定。目前，WCID-CIEF已成功應(yīng)用于重組人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）、諾如病毒（Norovirus，NV）和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）VLPs pI 的測(cè)定［14-16］。

本研究采用WCID-CIEF 技術(shù)測(cè)定重組人EV71 VLPs 的pI，考察了聚焦時(shí)間和尿素濃度對(duì)重組人EV71 VLPs pI 檢測(cè)的影響，結(jié)果表明，在3 000 V 電壓下，重組人EV71 VLPs 在4 ～5 min 即可完成聚焦，添加1 ～2 mol ／ L 尿素對(duì)重組人EV71 VLPs 的分離效果基本無(wú)影響。因此，EV71 VLPs pI 檢測(cè)方法確定為：4% Pharmalyte pH3-10，0. 35%甲基纖維素，1% pI marker（4. 05 和8. 40），1 500 V 預(yù)聚焦1 min，3 000 V 聚焦5 min。方法的驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和中間精密度良好。重組人EV71 VLPs 的實(shí)測(cè)pI 為6. 46（n = 12，RSD =0. 14%），與其理論pI（6. 08）相差0. 38 個(gè)pH 單位，實(shí)測(cè)值和理論值基本一致。

綜上所述，本研究建立了重組人EV71 VLPs pI的WCID-CIEF 測(cè)定方法，為EV71 VLPs 的質(zhì)量評(píng)價(jià)提夠了有效手段。