胡澤斌，孫彬裕，劉湘，蘭更欣，孫晶，于婷，黃杰

1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所，北京 100050；2. 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，北京 101111

目前，人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者建庫(kù)、HLA 群體遺傳多態(tài)性、HLA 生物學(xué)功能、實(shí)體器官和造血干細(xì)胞移植供受者組織相容性配型等［1-3］。HLA 基因配型可直接判別供受者之間的相容性，在DNA 水平上區(qū)分同源異源性。對(duì)于實(shí)體器官及造血干細(xì)胞移植，供受者雙方的HLA基因型匹配程度顯著影響移植受體的長(zhǎng)期存活率，匹配程度越高，長(zhǎng)期存活率越高，HLA 基因型主要是指HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 個(gè)位點(diǎn)［4-5］。腎臟、肝臟等實(shí)體器官移植對(duì)HLA 基因型匹配程度要求低于造血干細(xì)胞移植，因此，一般可使用低中分辨率的HLA 基因分型檢測(cè)試劑；骨髓移植或造血干細(xì)胞移植必須采用高分辨的HLA 分型檢測(cè)，避免發(fā)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植失?。?-7］。近年，中華骨髓庫(kù)正在積極倡導(dǎo)高分入庫(kù)，即對(duì)HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 等5 個(gè)基因座位進(jìn)行4 位高分辨率分型檢測(cè)，以期從根本上提高HLA 配型效率。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有準(zhǔn)確量值的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，其定值是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值賦值的過(guò)程［8］。測(cè)定特性值有許多有效技術(shù)途徑［9］，包括通過(guò)一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用一種或多種方法進(jìn)行測(cè)量。具體選擇的方法取決于該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的類(lèi)型、預(yù)期用途、參加實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)、所用方法的質(zhì)量及評(píng)估特性值的試劑能力。中國(guó)食品藥品檢定研究院研制的HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品為定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本研究采用多家具有良好資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR-SSO 法、PCR-SBT 測(cè)序法、NGS 測(cè)序法進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定的方式對(duì)其進(jìn)行定值，其中PCR-SBT 測(cè)序方法是目前世界衛(wèi)生組織推薦的HLA 分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1 材料與方法

1. 1 參考品 HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品（編號(hào)1 ～38）由中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所提供。

1. 2 主要試劑 One Lambda-All Type NGS 11 位點(diǎn)擴(kuò)增試劑（NGS 測(cè)序法）、One Lambda-SeCore A、B、C、DQB1、DRB1 Locus Sequencing Kit（PCR-SBT 測(cè)序法）由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 位點(diǎn)基因高分辨分型試劑盒（PCR-SBT 測(cè)序法）由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供；Lifecodes A、B、C、DQB1、DRB1 typing kit（PCR-SSO 法）由北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 核酸分型檢測(cè)試劑盒（PCR-SBT 法）由德必碁生物科技（廈門(mén)）有限公司提供；國(guó)際HLA 質(zhì)控盤(pán)IHWG-SP Reference Pannel由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1. 3 HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定方法 選擇德必碁生物科技（廈門(mén)）有限公司、賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司、北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司、北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司4家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。每家實(shí)驗(yàn)室分發(fā)3 套HLA組織配型基因分型國(guó)家參考品，干冰運(yùn)輸，2 ～8 ℃保存在5 d 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，-20 ℃保存在15 d 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。各試驗(yàn)均采用各自的HLA 分型檢測(cè)試劑檢測(cè)，在各自的檢測(cè)平臺(tái)上進(jìn)行獨(dú)立數(shù)據(jù)分析。共檢測(cè)38 支國(guó)家參考品，PCR-SBT 測(cè)序法和NGS 測(cè)序法對(duì)每個(gè)樣本測(cè)定1 次，PCR-SSO 法對(duì)每個(gè)樣本測(cè)定3 次。

1. 4 HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 將國(guó)際組織相容性工作組的HLA 質(zhì)控盤(pán)（IHWG-SP Reference Pannel）干冰運(yùn)輸至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，采用PCR-SBT測(cè)序法同步檢測(cè)HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品和IHWG-SP Reference Pannel 的51 個(gè)樣本，作為實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制。

2 結(jié) 果

2. 1 協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn) 4 家協(xié)作單位分別檢測(cè)38 支HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品樣本，HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 個(gè)位點(diǎn)均全部檢出。北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司PCR-SBT 測(cè)序法分型結(jié)果見(jiàn)表1，德必碁生物科技（廈門(mén)）有限公司和賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司的PCR-SBT 測(cè)序法分型結(jié)果、賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司的NGS 測(cè)序法分型的前4 位高分辨分型結(jié)果均與表1 中的前4 位高分辨分型結(jié)果一致；北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司PCR-SSO 法的前2 或4 位中高分辨分型結(jié)果與表1 的前2 位或4 位結(jié)果一致。最終取HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 的PCR-SBT 測(cè)序法前4位高分辨分型結(jié)果作為HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品的協(xié)作標(biāo)定結(jié)果。

表1 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司PCR-SBT 測(cè)序法的分型結(jié)果Tab. 1 Typing result by PCR-SBT sequencing by Beijing CapitalBio Technology Co.，Ltd

2. 2 國(guó)際質(zhì)控盤(pán)的檢測(cè) 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司采用PCR-SBT 測(cè)序法檢測(cè)38 支HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品，可全部檢出，結(jié)果同2. 1項(xiàng)；IHWG-SP Reference Pannel 的51 份樣本全部檢出，且HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型結(jié)果與IHWG公布結(jié)果一致，表明北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司采用PCR-SBT 測(cè)序法對(duì)HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 討 論

本研究中協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室均為HLA 分型檢測(cè)領(lǐng)域有較大影響力的國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)，其相應(yīng)試劑均具有良好的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，為HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定提供了保障。PCR-SSO法常用于臨床肝臟腎臟等器官移植中的HLA 分型，可報(bào)告2 或4 位HLA 中高分辨HLA 分型信息。PCR-SBT 測(cè)序法是目前世界衛(wèi)生組織及國(guó)際組織相容性工作組（International Histocompatibility Working-Group，IHWG）共同推薦的HLA 分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可直接測(cè)得序列，報(bào)告4 或6 位HLA 高分辨分型信息，但僅能檢測(cè)部分外顯子，如Class-Ⅰ，大部分廠家試劑僅是檢測(cè)外顯子2、3、4，部分會(huì)單獨(dú)提供5、6外顯子測(cè)序，其他部分無(wú)法檢測(cè)，對(duì)2、3、4 外顯子的多態(tài)性的檢測(cè)也是有限的。NGS 測(cè)序法可報(bào)告4、6或8 位的HLA 高分辨分型信息，NGS 法不僅能夠測(cè)全長(zhǎng)，還能夠較好地區(qū)分等位基因，在罕見(jiàn)基因和新基因的檢測(cè)上具有較大優(yōu)勢(shì)［10-13］。因此，在HLA 分型檢測(cè)方法上，本研究不僅選擇了1 家實(shí)驗(yàn)室采用PCR-SSO 分型法對(duì)38 支國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)，還聯(lián)合2 家實(shí)驗(yàn)室采用金標(biāo)準(zhǔn)PCR-SBT 測(cè)序法對(duì)38 支國(guó)家參考品中臨床檢測(cè)中要求的部分外顯子進(jìn)行直接測(cè)序，且聯(lián)合2 家實(shí)驗(yàn)室采用NGS 測(cè)序法對(duì)38支國(guó)家參考品的全部外顯子進(jìn)行測(cè)序，研究結(jié)果表明，PCR-SSO、PCR-SBT、NGS 3 種方法對(duì)38 支國(guó)家參考品的分型結(jié)果完全相符，進(jìn)一步保障了國(guó)家參考品定值的準(zhǔn)確性。

IHWG 發(fā)布了一套HLA 序列多態(tài)性參考品質(zhì)控盤(pán)（IHWG-SP Reference Pannel），共包含來(lái)自不同個(gè)體的51 份DNA 樣本，是基于不同種族和地域的多樣性基因樣本，極具代表性，這些樣本的基因型已經(jīng)多種HLA 基因分型方法驗(yàn)證，包括SBT 測(cè)序法，常用于國(guó)內(nèi)外免疫遺傳學(xué)和組織相容性實(shí)驗(yàn)室用于HLA 分型檢測(cè)的質(zhì)量控制及HLA 分型試劑的測(cè)試驗(yàn)證［14-15］。本研究采用該套IHWG 質(zhì)控盤(pán)作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的質(zhì)量控制，51 份DNA 樣本的分型檢測(cè)結(jié)果與IHWG 公布結(jié)果完全一致，表明本研究對(duì)HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品定值結(jié)果的可信度。

本研究對(duì)HLA 組織配型基因分型國(guó)家參考品定值進(jìn)行了準(zhǔn)確的協(xié)作標(biāo)定，能夠滿(mǎn)足其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，可用于HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，適用于熒光PCR 法、PCR熔解曲線(xiàn)法、PCR-SSP 法、PCR-SSO 法、PCR-SBT 和NGS 測(cè)序法。采用本參考品進(jìn)行準(zhǔn)確性檢測(cè)時(shí)，其分型結(jié)果在制造商標(biāo)示的分辨率水平上應(yīng)與參考品已知基因分型結(jié)果相符。