尹光文, 劉佳音, 閆家笛, 耿朦朦, 張譯丹

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450052

尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是由人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染引起的常見性傳播疾病(sexually transmitted diseases,STD)，主要表現(xiàn)為外生殖器和肛周增生性良性病變，但有演變?yōu)槟[瘤和巨大型尖銳濕疣(Buschke-Lowenstein tumor,BLT)的可能。CA具有增生快、傳染性強(qiáng)、易于復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，可能與CA組織中存在角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和凋亡有關(guān)[1]。HPV感染、CA的發(fā)病與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)[2]，但確切機(jī)制尚未明了。Toll樣受體家族(Toll-like receptors,TLRs)是一類在固有免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用并且參與炎癥過程的跨膜蛋白。其中TLR9能夠被病毒及細(xì)菌DNA激活，啟動髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)依賴性信號傳導(dǎo)途徑，激活核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和子蛋白-1(activator protein-1,AP-1)，釋放多種炎癥相關(guān)因子參與免疫應(yīng)答[3]。NF-κB調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，經(jīng)由多種信號傳導(dǎo)通路調(diào)控相關(guān)信號傳導(dǎo)，參與包括細(xì)胞生存與凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、分化和生長等多種病理生理過程[4]。目前相關(guān)研究顯示，TLRs與NF-κB參與包括病毒感染等多種疾病過程[3]，但關(guān)于CA組織中TLR9和NF-κB表達(dá)情況以及二者之間的關(guān)系尚不清楚。本研究采用免疫組化SP法檢測TLR9和NF-κB在CA組織和正常包皮組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性，探討二者在CA發(fā)生和發(fā)展中可能存在的意義。

1 資料與方法

1.1 材料來源

實(shí)驗組50例CA標(biāo)本均來自2019年9月至2020年9月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科門診的CA患者，其中男30例，女20例；年齡16～58歲，平均(32.64±9.70)歲；病程14～100 d，平均(46.80±19.20)d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會性病學(xué)組制定的《尖銳濕疣診療指南(2014)》[5],符合CA診斷；②醋酸白檢測陽性；③取材前未行任何局部及系統(tǒng)藥物治療，或者激光、冷凍和光動力等物理治療手段；④1年內(nèi)未接受任何免疫抑制劑或增強(qiáng)劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)性疾病；②妊娠期或哺乳期。對照組20例標(biāo)本均取自該院泌尿外科成年男性包皮環(huán)切術(shù)后切除的正常包皮組織，組織病理學(xué)檢查均證實(shí)為正常包皮上皮組織。所有標(biāo)本取材后置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，連續(xù)做4 μm厚度切片。本研究通過鄭州大學(xué)基層倫理審查委員會批準(zhǔn)(科研快審2016-71)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑

鼠抗人TLR9單克隆抗體來自Abcam公司，兔抗人NF-κB p65多克隆抗體、3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色(DAB)試劑盒及過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SP)試劑盒均來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測TLR9和NF-κB的表達(dá)情況 兩組標(biāo)本均在同等條件下進(jìn)行染色，每個切片染色均設(shè)置已知染色陽性的切片為陽性對照，PBS液代替抗體為空白對照，整個過程嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。

1.3.2 結(jié)果判定 TLR9主要定位在角質(zhì)形成細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜，NF-κB主要定位在角質(zhì)形成細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核。SP染色下觀察到淺黃色、黃色或棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。評定標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]對陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分級評分。在光學(xué)顯微鏡下通過高倍視野(400×)隨機(jī)選擇每個組織切片的5個不同區(qū)域，并將平均分?jǐn)?shù)作為最終結(jié)果。①陽性細(xì)胞百分比評分：0分：0～10%；1分：11%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。②染色強(qiáng)度評分：0分：無染色；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。將上述兩個分?jǐn)?shù)的乘積作為最終分?jǐn)?shù)，最終得分為0分表示為陰性(-)，1～4分表示為弱陽性(+)，5～8分表示為陽性(++)，9～12分表示為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對所有實(shí)驗獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計描述和分析。TLR9與NF-κB的陽性表達(dá)率差異比較采用2檢驗；TLR9與NF-κB的陽性表達(dá)強(qiáng)度差異比較采用秩和檢驗；CA組織中TLR9和NF-κB表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR9在CA組織和正常包皮組織中的表達(dá)

50例CA患者標(biāo)本中，47例(94.00%)TLR9不同程度表達(dá)于基底層、棘層細(xì)胞及顆粒層，為胞質(zhì)或胞膜內(nèi)黃色或棕黃色顆粒，表達(dá)強(qiáng)度多為++～+++;20例正常包皮組織中未觀察到明顯的黃色顆粒，僅弱陽性2例(10.00%)，表達(dá)強(qiáng)度多為-～+(圖1)。兩組TLR9陽性表達(dá)率(2=48.00，P<0.05)和陽性表達(dá)強(qiáng)度(H=-6.56，P<0.05)差異均統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

圖1 TLR9、NF-κB在CA、正常包皮組織中的表達(dá)(SP染色)

表1 TLR9和NF-κB在CA組及對照組中的表達(dá) (例)

2.2 NF-κB在CA組織和正常包皮組織中的表達(dá)

50例CA患者標(biāo)本中，49例(98.00%)NF-κB不同程度表達(dá)于棘層細(xì)胞內(nèi)，為胞質(zhì)或胞核內(nèi)黃色或棕黃色顆粒，表達(dá)強(qiáng)度多為++～+++;20例正常包皮組織中未觀察到明顯的黃色顆粒，僅弱陽性4例(20.00%)，表達(dá)強(qiáng)度多為-～+(圖1)。兩組NF-κB陽性表達(dá)率(2=47.27，P<0.05)和陽性表達(dá)強(qiáng)度(H=-6.56，P<0.05)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.3 CA組織中TLR9和NF-κB表達(dá)的相關(guān)性分析

在47例TLR9陽性表達(dá)的患者中，NF-κB全為陽性。在NF-κB陽性表達(dá)的49例患者中，47例TLR9陽性，2例陰性。Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示CA組織中TLR9和NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.57，P<0.05)。

3 討論

TLRs家族能夠啟動天然免疫反應(yīng)，并在調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中起重要作用。TLRs擁有Ⅰ型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，可以識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等，還可以識別由死亡或損失細(xì)胞生成的損傷相關(guān)分子模式。不同的TLRs家族成員識別不同的PAMP。TLR9作為TLRs家族的一員，識別細(xì)菌、病毒基因組中含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤寡核苷酸(CpG)基序的DNA，在病毒感染后的免疫反應(yīng)中起重要作用[7]。TLR9通過MyD88依賴性信號傳導(dǎo)通路啟動下游信號傳遞，刺激NF-κB和AP-1激活，調(diào)節(jié)α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、Ⅰ型干擾素(Ⅰ-interferon,Ⅰ-IFN)和IL等多種細(xì)胞因子、趨化因子的分泌并最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)[8]。適度免疫反應(yīng)能夠有效保護(hù)機(jī)體防止微生物入侵，但過度反應(yīng)則會導(dǎo)致一些疾病產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR9通過產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、抑制凋亡、免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移來參與疾病的發(fā)生發(fā)展[3,9-10]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，CA患者與正常包皮組織中TLR9陽性表達(dá)率及陽性表達(dá)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CA組織中存在TLR9的過表達(dá)。推測CA患者由于免疫功能受損，不能及時清除HPV，造成慢性持續(xù)感染，TLR9被持續(xù)過度激活，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成、免疫逃逸、抑制凋亡來參與CA的發(fā)生發(fā)展。

NF-κB是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，而且也是TLRs介導(dǎo)的信號通路中關(guān)鍵下游信號分子。它通過增加特定細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)控宿主炎癥、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞生長。NF-κB至少調(diào)控27種不同的編碼基因、靶基因編碼蛋白質(zhì)和microRNAs(miRNAs)等，編碼蛋白包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、補(bǔ)體、黏附分子、免疫識別受體、氧化應(yīng)激相關(guān)酶以及急性期蛋白等多種免疫相關(guān)因子[11]，具有廣泛的生物效應(yīng)。NF-κB參與免疫細(xì)胞的激活，調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化增殖凋亡、B細(xì)胞和T細(xì)胞的生長分化，并且擁有精確的正負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制[12]。近年發(fā)現(xiàn)，NF-κB的異常激活和反饋機(jī)制破壞與多種臨床疾病相關(guān)，包括潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病關(guān)節(jié)炎以及多種癌癥，如口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和骨髓瘤等[13-14]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，CA組NF-κB陽性表達(dá)率和陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常包皮組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。NF-κB在CA組織中的過表達(dá)提示NF-κB受到HPV持續(xù)感染后異常激活及反饋機(jī)制破壞，促進(jìn)異常增殖和血管生成、抑制凋亡，產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)。

本研究顯示，CA組織中TLR9和NF-κB存在過表達(dá)，且二者存在一定的相關(guān)性(r=0.57,P<0.05)，存在協(xié)同效應(yīng)。也有研究顯示CA組織中TLR9呈低表達(dá)[15]。研究結(jié)果的差異一方面可能與研究樣本量有關(guān)，另一方面推測在HPV感染機(jī)體的自然病程中，TLR9激活的不同結(jié)果可能取決于HPV對TLR9的抑制強(qiáng)度和宿主免疫應(yīng)答之間的平衡。如免疫反應(yīng)在一段時間內(nèi)不能有效清除HPV感染，TLR9將可能在持續(xù)感染的組織中過表達(dá)。

綜上所述，TLR9和NF-κB在CA組織中均為高表達(dá)，二者表達(dá)呈正相關(guān)，推測二者協(xié)同參與CA的發(fā)生與發(fā)展。但本研究樣本量較少，二者在CA發(fā)病中的確切作用尚需進(jìn)一步研究。