王卓, 李海翩, 陳小紅

1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣東 廣州 510620; 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種起源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，具有高度侵襲性且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要累及皮膚及粘膜[1]。惡性黑素瘤確診時(shí)，腫瘤細(xì)胞的異型性是確定病變組織良惡性的重要指標(biāo)，而組織切片中濃密黑色素顆粒的遮擋，會(huì)影響病理醫(yī)生的觀察，且對(duì)免疫組化染色結(jié)果的識(shí)別判斷帶來(lái)困難。在臨床病理研究中，常對(duì)腫瘤標(biāo)本脫色素處理后再進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，但脫色素后極易引起切片組織脫落，一直是研究者困擾的問(wèn)題之一[2]。

本研究選取2例惡性黑素瘤患者的組織切片進(jìn)行高錳酸鉀/草酸脫色素處理[3]，其中每例患者選取20張切片，每種脫色素方法中，取1張切片進(jìn)行HE染色，4張切片應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Stathmin的表達(dá)，探討脫色素技術(shù)在惡性黑色素瘤免疫組化研究中的應(yīng)用條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2例經(jīng)病理診斷為惡性黑素瘤[1]的存檔蠟塊，經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后，切成4 μm厚的連續(xù)切片備用。高錳酸鉀和草酸為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；PBS緩沖液及檸檬酸修復(fù)液為Boster生物公司產(chǎn)品；蘇木素染色液及伊紅水溶液為L(zhǎng)eagene公司產(chǎn)品；Stathmin為CST公司產(chǎn)品；MaxVisionTM試劑盒及DAB顯色液試劑盒為福州邁新公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；脫色素處理；此后步驟同HE常規(guī)操作流程。

1.2.2 免疫組化染色 烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)；脫色素處理；此后步驟同免疫組化常規(guī)操作流程。

1.2.3 脫色素處理 設(shè)置4種不同高錳酸鉀草酸濃度及處理時(shí)間：①0.5%高錳酸鉀滴片，室溫處理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；②0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；③ 0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次；④在石蠟切片脫蠟之后進(jìn)行后固定，即脫色素之前用4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗，0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次。觀察不同處理后HE染色及免疫組化染色效果。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

比較4種方法對(duì)既往報(bào)道過(guò)的高錳酸鉀及草酸脫色素時(shí)所使用的濃度及時(shí)間，結(jié)果(表1)顯示：方法①高錳酸鉀濃度0.5%、處理時(shí)間為10 min時(shí)，組織脫片現(xiàn)象嚴(yán)重，嚴(yán)重影響病理觀察及診斷；方法②降低高錳酸鉀濃度至0.25%時(shí)仍有輕微脫片現(xiàn)象；方法③④降低高錳酸鉀濃度至0.25%、處理時(shí)間縮短至3 min時(shí)可獲得較好的脫色效果，方法③偶發(fā)輕微脫片情況，方法④在脫色素處理前使用多聚甲醛進(jìn)行固定，可進(jìn)一步保證切片的完整性(圖1)，無(wú)組織脫片現(xiàn)象。

圖1 采用方法④對(duì)皮膚惡性黑素瘤組織切片進(jìn)行脫色素處理的前后對(duì)比，脫色素前大量黑色素顆粒遮蓋了細(xì)胞形態(tài),脫色素后細(xì)胞形態(tài)清晰

表1 不同脫色素方法處理過(guò)程及結(jié)果

2.2 Stathmin免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色切片脫落情況與HE染色結(jié)果類似，方法①高錳酸鉀濃度為0.5%且處理時(shí)間為10 min時(shí)組織脫片現(xiàn)象嚴(yán)重，無(wú)法判讀；方法②中仍有輕微脫片情況，且會(huì)引起抗原抗體結(jié)合的敏感性下降，導(dǎo)致免疫組化染色呈弱陽(yáng)性甚至假陰性；方法③能在脫色素的同時(shí)盡可能地保證組織切片的完整性以及抗原的敏感性，但仍有偶發(fā)輕微脫片現(xiàn)象；方法④幾乎無(wú)脫片現(xiàn)象，免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性，脫色素效果可(圖2)。

圖2 三組實(shí)驗(yàn)方法下皮膚惡性黑素瘤的免疫組化染色效果：未進(jìn)行脫色素時(shí)，大量黑色素顆粒沉積；方法②染色呈弱陽(yáng)性;方法④染色效果可

3 討論

免疫組化染色中適宜的脫色素法應(yīng)同時(shí)具備以下幾個(gè)條件：脫色素效果較好；細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生破壞，組織無(wú)丟失或脫落；組織抗原的特異性及敏感性未發(fā)生改變。免疫組化過(guò)程中，組織內(nèi)的抗原與特異性抗體結(jié)合，DAB顯色后大多呈現(xiàn)棕黃色顆粒，但惡性黑素瘤細(xì)胞中常含有大量濃重粗大的黑色素顆粒，造成組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)不清楚，嚴(yán)重干擾HE染色下細(xì)胞形態(tài)的觀察及免疫組化染色情況的判斷，從而導(dǎo)致診斷困難。

黑色素由黑色素母細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體合成，是一種不含鐵而含硫的色素，性質(zhì)非常穩(wěn)定，完全不溶于水，且不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，但可以被高錳酸鉀、過(guò)氧化物等強(qiáng)氧化劑漂白[4]。脫色原理是打開(kāi)黑色素的酚環(huán)，使黑色素脫色。組織切片脫色素的方法有很多，包括高錳酸鉀草酸法、過(guò)氧化氫脫色法、氯化鉀乙醇鹽酸法及溴水脫色法等[5-7]，其中高錳酸鉀草酸法及過(guò)氧化氫法最常用[8]。McGovern等[9]研究顯示高錳酸鉀草酸法較過(guò)氧化氫法而言具有操作簡(jiǎn)便、脫色素徹底、不易脫片等特點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)中選用高錳酸鉀草酸法進(jìn)行脫色素處理。

既往傳統(tǒng)的高錳酸鉀草酸法脫色素費(fèi)時(shí)長(zhǎng),且長(zhǎng)時(shí)間的浸泡易造成組織脫片，并且改變組織的抗原性[10]。王從陽(yáng)等[10]發(fā)現(xiàn)使用0.25%高錳酸鉀處理標(biāo)本，脫色素效果好且無(wú)脫片現(xiàn)象。Kligora等[11]研究發(fā)現(xiàn)高錳酸鉀濃度在0.125～0.5 g/L時(shí)，黑色素顆粒不能完全去除，然而當(dāng)增加高錳酸鉀溶液濃度時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變，或出現(xiàn)大量無(wú)結(jié)構(gòu)的“影子”細(xì)胞，甚至出現(xiàn)組織丟失或脫片。郭以河等[3]發(fā)現(xiàn)0.5%高錳酸鉀溶液處理5 min聯(lián)合2%草酸溶液處理2 min后色素基本祛除，HE染色細(xì)胞形態(tài)清晰，免疫組化表達(dá)效果良好。Orchard等[12]發(fā)現(xiàn)使用高錳酸鉀草酸脫色素法會(huì)引起某些抗原的特異性及敏感性發(fā)生改變。林興滔等[13]發(fā)現(xiàn)利用0.1%高錳酸鉀進(jìn)行褪黑色素耗時(shí)短、脫色素完全，且可保存更多抗原信號(hào)；而相同的脫黑色素時(shí)間對(duì)于不同抗原的影響程度不一致，脫色素時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)影響抗原的表達(dá)從而出現(xiàn)假陰性率升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合既往研究結(jié)果在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用0.25%高錳酸鉀溶液及2%草酸溶液為脫色劑，處理時(shí)長(zhǎng)控制在3 min時(shí)，不僅極少發(fā)生脫片現(xiàn)象，同時(shí)保證較好的脫色素效果及保證組織的抗原活性不受影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)高錳酸鉀濃度提高時(shí)，脫色素效果雖好，但組織切片脫片的概率也隨之升高；當(dāng)高錳酸鉀處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，抗原的敏感性下降，造成免疫組化染色結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。

為進(jìn)一步探討脫色素組織的免疫組化效果，本實(shí)驗(yàn)將黑素瘤脫色素處理和免疫組化染色結(jié)合，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓抗原修復(fù)后再脫色素處理，脫色顆粒效果佳，組織不易脫片。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾嘗試在抗原修復(fù)之前就進(jìn)行脫色素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織脫片情況嚴(yán)重，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的免疫組化染色。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因推測(cè)可能是由于抗原修復(fù)這一步驟本身就極易造成組織的破壞和脫落，假如在這之前使用高錳酸鉀/草酸進(jìn)行脫色素處理，組織與玻片間的黏附性受到破壞，在抗原修復(fù)時(shí)，不斷沸騰的高溫液體極易引起組織破壞、缺失及脫落。唐潔等[14]認(rèn)為先進(jìn)行脫色素而后進(jìn)行抗原修復(fù)出現(xiàn)組織脫片嚴(yán)重的原因是脫色素時(shí)強(qiáng)氧化劑作用于切片，破壞了載玻片上涂膠多聚賴氨酸陽(yáng)離子基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，組織和載玻片黏附性降低。故本實(shí)驗(yàn)中，黑素瘤切片標(biāo)本先進(jìn)行抗原修復(fù)，再用4%多聚甲醛進(jìn)行后固定，而后使用0.25%高錳酸鉀及2%草酸進(jìn)行脫色素，可得到較好的脫色素效果及免疫組化效果。

本研究結(jié)果顯示，采用0.25%高錳酸鉀溶液及2%草酸溶液進(jìn)行脫色素處理，時(shí)間控制在3 min時(shí)，組織的抗原性依然保持良好，未脫色素及脫色素后的抗原表達(dá)情況基本一致，是適用于惡性黑素瘤的HE染色及Stathmin免疫組化染色的脫色素方法，值得進(jìn)行臨床參考和推廣。但不同的抗原對(duì)脫色素時(shí)間的把握不同。故建議首次使用的抗原標(biāo)記進(jìn)行免疫組化染色需脫色素時(shí)，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)探索合適的脫色素濃度及時(shí)間。