李亞嬌，孫國琴，郭九峰，王海燕，于傳宗，龐 杰

（1.內蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，內蒙古呼和浩特 010031；2.內蒙古大學 物理科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特 010021）

近年來，人們越來越關注健康飲食，養(yǎng)生已成為現(xiàn)代人追求的生活方式，食用菌不僅味道清鮮、營養(yǎng)豐富且具有藥食同源的功效，其加工產(chǎn)品也已成為人們青睞的綠色、健康食品，深受國內外學者關注，因此，食用菌的資源及種質開發(fā)存在巨大的市場潛力[1-3]。目前，生物技術在食用菌領域應用方面已取得了很大進步，尤其是原生質體技術為食用菌菌種改良、新品種選育、野生種馴化的研究提供了一個十分重要的基礎性方法[4-5]。與自然育種、雜交育種、誘變育種等相比，利用原生質體的生物學特性進行原生質體融合育種，具有優(yōu)勢[6-8]。脫掉細胞壁后的原生質體，解除了菌株間物理上、生理上的屏障，實現(xiàn)了種間、屬間及科間遠緣融合進行染色體交換、重組，最后經(jīng)過再生培養(yǎng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子[9-11]，從而有目的地選育具有突出優(yōu)良性狀的新菌株和進行野生菌馴化，以滿足生產(chǎn)需要、社會需求。盡管基因工程和基因編輯領域取得了長足的進展，但原生質體融合技術在生物育種和種質創(chuàng)新方面仍然具有不可替代的優(yōu)勢和地位，筆者就原生質體融合技術在食用菌育種方面取得的進展進行綜述，以期為進一步挖掘其科研生產(chǎn)潛力提供指導。

1 原生質體的制備與再生

原生質體制備與再生易受選取材料和外界條件的影響，要想獲得最佳的制備和再生條件，需要對各因素進行綜合研究。

1.1 原生質體的制備

原生質體是指含有該物種的全部遺傳物質，且在外力的作用下被脫掉細胞壁的細胞[12]。原生質體融合的第一步為原生質體制備，早期運用機械、超聲等物理方法進行原生質體制備，效果欠佳。直到1972年DE VRIES 等[13]成功地利用酶解法分離得到裂褶菌原生質體，1981年食用菌脫壁酶問世，原生質體技術在食用菌上的應用才有了實質性進展[14-16]。食用菌屬于絲狀真菌，且不同種類的食用菌細胞壁成分存在差異，即原生質體制備條件因食用菌的種類不同而不同。酶解時間、酶解溫度、穩(wěn)滲劑種類及濃度、酶解pH 值、食用菌種類、菌齡、酶濃度等因素都影響活性原生質體的釋放。李春霞等[17]通過單因素篩選試驗，得到真姬菇原生質體的最佳酶解條件為酶解溫度32 ℃、酶解時間3.5 h、滲穩(wěn)劑0.6 mol/L甘露醇、溶壁酶濃度20 mg/mL，原生質體數(shù)量最大可達到6.75×106個/mL。春霞[18]以草原黑蘑hm8124-1（菌蓋棕色）、草原蘑菇hm910（菌蓋白色）兩個菌株搖培8 d 的菌絲體為試驗材料制備原生質體，當溶壁酶濃度為1.4%，25 ℃ 酶解4 h，可以制備足夠的原生質體。王金斌等[19]以褐色雙孢蘑菇棕秀一號為試驗材料，利用Design-Expert 軟件進行二次回歸分析，對褐色雙孢蘑菇制備原生質體的條件進行優(yōu)化，結果表明，原生質體最佳制備條件為1.35%溶壁酶+7.01%蝸牛酶、酶解溫度30.4 ℃、菌絲體菌齡8.36 d、酶解時間3 h，在此條件下原生質體產(chǎn)量高達4.39×107個/mL。婁海偉等[20]探究蛹蟲草單核芽生孢子的原生質體制備條件，響應面優(yōu)化試驗結果表明，蛹蟲草原生質體最適制備條件為溶壁酶質量分數(shù)2.06%、酶解溫度26.1 ℃、酶解時間2.57 h，在此條件下，原生質體得率的預測值為8.97×106個/mL，驗證試驗所得原生質體得率為（9.17±0.29）×106個/mL，預測值和試驗值差異不顯著，回歸模型擬合良好。宋天磊[21]對桑黃原生質體制備條件進行初步探索，發(fā)現(xiàn)桑黃菌絲體細胞壁在溶壁酶濃度為2%，25～30 ℃條件下酶解3 h 可達到較好的脫掉細胞壁效果，且原生質體的產(chǎn)量與菌齡沒有明顯的線性關系。

1.2 原生質體的再生

原生質體再生是指生物體（微生物或植物）細胞由原生質體重新形成細胞壁，直至形成菌或植株的過程，食用菌原生質體的再生率受再生培養(yǎng)基成分、pH 值、滲透壓穩(wěn)定劑的容量和種類等因素影響。馮婷婷等[22]采取單因素試驗和響應面法對影響蟹味菇原生質體再生條件的主要因素：菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類、溶壁酶濃度和酶解時間進行篩選與優(yōu)化，單因素試驗表明，原生質體最佳再生條件為菌齡6 d，滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L 甘露醇，溶壁酶濃度為2%，酶解3 h；響應面法表明，0.6 mol/L 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑時，最佳再生條件為菌齡7 d，溶壁酶濃度為2%，酶解4 h。白靜瑩等[23]分析不同葡萄糖濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 及不同pH 值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 對暴馬丁香桑黃原生質體再生率的影響，結果表明，當其他試驗條件一定，葡萄糖濃度為30 mg/mL 時，原生質體再生率最高，為23.67%；當其他試驗條件一定，pH 值為7 時，原生質體再生率最高，為19.33%。鄒彰毅等[24]以姬松茸JS01 為試驗材料，對姬松茸原生質體的再生條件進行優(yōu)化，結果表明，菌齡6 d，以0.6 mol/L MgSO4作滲透壓穩(wěn)定劑，溶壁酶濃度2.0%，酶解溫度30 ℃，酶解時間3 h，pH 值6.5，再生培養(yǎng)基為GM 時，原生質體的再生率最高，為1.12%。再生培養(yǎng)基中添加纖維二糖和VB1后，再生率為1.17%，較優(yōu)化結果提高了4.46%；首次通過在再生培養(yǎng)基中添加細胞壁前體物質及營養(yǎng)因子，進一步提高姬松茸原生質體的再生率。崔曉等[25]采用正交試驗法探究影響秀珍菇原生質體制備和再生的條件，對菌齡等7 個單因素、4 個復合因素條件和接種方式進行系統(tǒng)研究，結果表明，秀珍菇菌絲在改良液體PD 培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5 d，以0.6 mol/L 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，2.5%溶壁酶在30 ℃條件下水浴4 h，得到的原生質體濃度最大，為4.23×107個/mL；在TB3 再生培養(yǎng)基中采用單層混菌法接種原生質體，再生率最大，為2.35%。

2 原生質體融合

1965年，Strunk 第1 次在采絨革蓋菌中制備出原生質體，同時觀察到自發(fā)性融合現(xiàn)象，以此為開端，原生質體融合技術受到國內外學者廣泛關注并迅速發(fā)展[26-28]。原生質體融合技術在食用菌育種的應用上發(fā)揮著舉足輕重的作用，跨種、跨屬、跨科的融合也取得進展。原生質體融合有自發(fā)融合和誘導融合兩種情況，前者融合比較困難，融合率極低，無法應用于試驗研究；后者則需要通過人為干預融合，融合率顯著高于自發(fā)融合，誘導融合主要有生物融合法、化學融合法和物理融合法。

2.1 生物融合法

早在20 世紀60年代，生物學家發(fā)現(xiàn)一些紫外線滅活的病毒膜片能使細胞間產(chǎn)生凝聚和融合，如仙臺病毒1653 曾主要應用于細胞工程中的細胞融合技術，在病毒的外殼作用下直接產(chǎn)生這種細胞膜的融合，但此方法存在一定的不安全性、融合率低、操作較復雜，目前只在動物細胞融合中使用，未在食用菌原生質體融合領域采用[29-30]。

2.2 化學融合法

化學融合法始于20 世紀70年代，是比較常用的融合方法，原理是利用某種化學物質作用于原生質體，改變其細胞膜電位，發(fā)生細胞聚集，細胞膜結構發(fā)生變化，促使細胞膜融合，從而提高融合率[31]。常用的促融劑有聚乙二醇（PEG）、蟹合劑和二甲亞砜等，聚乙二醇促融劑最為常用。聚乙二醇法不僅對儀器設備要求不高，而且操作簡單、方便，但也存在缺點，聚乙二醇作為促融劑不好把握原生質體聚集成團的程度，還會對原生質體產(chǎn)生一定毒性，這樣原生質體容易受到損傷或損失，從而影響原生質體的再生率和融合率[32]。

化學融合法在食用菌原生質體融合技術中應用廣泛。陳小紅等[33]以茯苓和靈芝為親本菌株，探究出其原生質體融合的最佳條件為25%PEG4000、pH 值8.5、在35 ℃下融合20 min，獲得了可使RB-PDA平板穩(wěn)定變色的融合菌株，通過分子鑒定其主要具有茯苓的遺傳性狀，與靈芝的親緣關系較遠，但具備部分靈芝的遺傳性狀。王波[34]以白色金針菇菌株3W4 和白色金針菇菌株FMY1203 為親本，將雙親原生質體分別進行熱滅活（60 ℃，3 min）和化學滅活（2%EMS）處理后等量混合離心，加入融合劑（40%PEG，0.05 mol/L CaCl2）進行融合處理，獲得84 個再生菌株，且與親本具有拮抗；ISSR 分子標記分析表明，融合子與親本存在明顯差異。李麗君[35]選用黑色羊肚菌菌株M10（四川省農(nóng)業(yè)科學院選育的梯棱羊肚菌川羊肚菌1 號）和M20（山東農(nóng)業(yè)大學保存出菇品質良好、產(chǎn)量較高的六妹羊肚菌）作為原生質體融合的親本，在30 ℃水浴中以30%的PEG-CaCl2為助溶劑融合20 min，獲得6 株生長勢較好的羊肚菌菌株，將其與親本進行菌絲生長速度比較與出菇試驗，選育出2 株高產(chǎn)菌株R5 和R8。

2.3 物理融合法

物理融合法稍晚于化學融合法，于20 世紀80年代前后出現(xiàn)，具有可控制融合條件、無毒害、操作簡單易行、融合效率高且融合子成活率高等優(yōu)點，但對設備條件要求高且費用較貴[30]。最為常用的物理融合法是電融合法和激光誘導融合法，激光誘導融合法因為技術難度比較大，目前還在研究。

電融合法基本原理是原生質體在電場作用下，原生質體細胞緊密接觸，通過瞬時電壓擊穿細胞膜出現(xiàn)可逆性孔洞，短時間內即可恢復，從而引起原生質體膜的融合，使原生質體在短時間內發(fā)生融合[36-38]。任軒等[39]以杏鮑菇和平菇為親本菌株，兩菌株按1∶1混合，運用電場誘導使其電融合，1 MHz、250 V/cm的成串脈沖電壓，5.5 kV/cm 的融合脈沖電壓時，杏鮑菇和平菇原生質體成對率達到70%，融合率為3.2×10-3。燕曉翠[40]利用電場誘導糙皮側耳和釀酒酵母的原生質體融合，當交變電壓和交變頻率分別為30 V、1 100 kHz，脈沖場強、脈沖個數(shù)、脈沖間隔分別為6 kV/cm、4 個、10 μS 時，融合率為4.396×10-5，篩選出的3 株疑似融合株皆為親本原生質體融合的產(chǎn)物。

3 融合子的鑒定

如何鑒定原生質體融合子關系到整個融合是否成功，因為融合體中可能會存在親本、異核體、部分結合子、雜合二倍體、雜合系和融合子等，它們都會再生形成菌落，互相影響，從而抑制具有優(yōu)良性狀的融合子生長，所以如何鑒定并及時分離融合子，是原生質體融合成功的關鍵，尤為重要。鑒定融合子的常用方法有生物法和分子標記法。

3.1 生物法

3.1.1 菌落形態(tài)法 菌落形態(tài)法是對融合菌株進行形態(tài)學觀察，根據(jù)菌絲及菌落形態(tài)特征、生長速度、孢子形態(tài)等比對融合子再生菌落與親本菌落的差異性，并進行下一步篩選[26]。

3.1.2 細胞學形態(tài)法 原生質體融合子在萌發(fā)初期菌絲體核分布不同于親本，融合子再生菌絲細胞核分布非常混亂，可以根據(jù)這一特點鑒定融合子。具體方法為通過凹玻片微培養(yǎng)，然后用吉姆薩（Giemas）結合蘇木精進行染色，最后鏡檢，觀察比對菌絲頂端生長情況及分枝、核相和鎖狀聯(lián)合[30]。

3.1.3 拮抗實驗法 由于拮抗實驗法具有直觀、操作簡單的特點，一般應用較多，拮抗實驗具體方法是將兩個親本菌株與融合子菌株有間隔地接到同一培養(yǎng)皿上，融合子重組了雙親的遺傳物質，則有了新的遺傳特性，當菌絲長到交匯處時，如果與雙親都不親和就會出現(xiàn)拮抗線，且越明顯說明它們遺傳差異越大，若菌絲體無分界線則為同一菌株[41]。

3.1.4 出菇試驗法 通過讓融合子和親本出菇，可以直接觀察融合子的形態(tài)特征，由于融合子為雜種異核體，在適宜的條件下，有可能會形成子實體，其性狀會介于兩親本，因此，可以從子實體的形態(tài)、色澤等特征上進行篩選[28]。

若要鑒定融合子融合是否成功大多采用菌落形態(tài)、細胞學、拮抗實驗、出菇試驗等方法相互結合、相互印證?？盗种サ萚42]探究金針菇與平菇遠緣親本原生質體融合，通過菌絲形態(tài)、細胞學觀察，拮抗實驗、出菇試驗驗證融合再生菌株，從18 個再生菌株中選擇出1 株耐34 ℃高溫金針菇菌株，且融合菌株為子實體粗壯、原基形成較多、菇形好的金針菇新品種，命名為F1P8。孫艷穎等[43]采用原生質體制備與再生篩選單核菌絲，進行香菇L808 和A288 雜交育種研究，初篩獲得15 個雜交菌株。利用酯酶同工酶技術復篩，獲得香菇原生質體雜交子10 個，然后進行出菇試驗，結果表明，7 個雜交子正常出菇，2S-21、2S-28出菇早、產(chǎn)量高；2S-24 出菇雖晚但菇蓋圓正，菇柄短粗、單生，商品性狀好。2S-21、2S-24 和2S-28 的生物學效率達到82.70%、61.64%和88.82%，明顯高于親本香菇L808 和A288 的生物學效率（46.23%和50.78%）。孫艷穎[44]又以滑子菇早豐112 和滑子菇C3 為親本進行原生質體的融合，得到的滑子菇原生質體融合子再生后，經(jīng)過初步篩選有18 個菌株和雙親具有拮抗現(xiàn)象，說明融合子與滑子菇親本在遺傳性狀上具有差異。根據(jù)酯酶同工酶復篩結果，獲得14 個融合子，進行出菇試驗，有10 個融合子成功出菇，其中有3 個出菇性狀較好的菌株。

3.2 分子標記法

分子標記，又稱DNA 標記，是生物遺傳標記的一種，指可遺傳并可以檢測以及能用來作為指紋區(qū)分鑒定個體特征的DNA 片段，能夠反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征DNA 片段，直接反映基因組中DNA 間的差異[27]。食用菌原生質體融合子的分子鑒定主要采用ISSR 標記技術和RAPD 標記技術。

3.2.1 ISSR 標記技術 簡單序列間重復序列（ISSR）是一種在PCR 基礎上發(fā)展起來的新型分子標記技術，具有快速、高效、耗資少、模板DNA 用量少、遺傳多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點，是鑒定和確定品種遺傳多樣性的理想方法[45]。孫曉瑞[5]采用ISSR分子標記對秀珍菇和榆黃蘑原生質體融合情況進行遺傳驗證，證實融合子含有雙親遺傳物質。鄭錦榮[46]探究金針菇和巨大口蘑原生質體融合育種，對獲得的3 株融合菌株R13、R14、R15 利用ISSR 技術進行遺傳系數(shù)和聚類分析來鑒定融合株，結果表明，3 株融合菌株與巨大口蘑遺傳相似系數(shù)均為0.49，與金針菇的遺傳相似系數(shù)均為0.45。可以初步判斷R13、R14、R15 均為新菌株，與雙親親緣關系不明顯。蔡佺佑[47]將秀珍菇與巨大口蘑的原生質體進行融合，應用形態(tài)學特征觀察比較，篩選獲得2 株融合菌株：R7-1 和R7-2，且菌絲生長速度快，與親本形成較為明顯的拮抗線，采用ISSR 技術對R7-1 和R7-2 兩株融合菌株進行鑒定，初步說明R7-1 和R7-2 均為新菌株。

3.2.2 RAPD 標記技術 RAPD 即隨機多態(tài)性DNA技術，是由美國科學家WILLIAMS 等[48]和WEISH 等[49]于1990年和1991年分別研究提出的一種新型DNA分子標記技術，又稱為任意引物PCR。隨機多態(tài)性DNA 技術，是以PCR 為基礎，以一個隨機寡核苷酸序列為引物（約10 個堿基），以試驗材料基因組DNA 為模板，進行PCR 反應，找出擴增段的多態(tài)性。該技術應用廣泛，無需專門設計RAPD 擴增反應引物，引物具有通用性，成本低，DNA 樣品用量少且純度要求不高，該技術簡單易行、省時省力。楊珊[6]以猴頭菌株0605 和猴頭菌刺長為試驗材料進行原生質體融合，第一輪挑選出67 株生長速度較快的融合再生菌株，第二輪采用SSCP 和RAPD 法進行鑒定，篩選出14 株融合菌株，分析14 株融合菌株生物學性狀，可知R17 的菌絲體多糖含量比親本0605 提高了7.43%；R51 和R53 的菌絲體生長速度最快，比親本菌株0605 提高了24.48%。王珂[50]利用雙滅活融合技術，將梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生質體融合，采用RAPD 標記對親本及融合子進行鑒定，并進行聚類分析，結果表明，雙親本與融合子分為3 大類群：第一類群包括親本梯棱羊肚菌（P1），第二類群包括所有融合子，第三類群包括親本六妹羊肚菌（P2），從聚類分析可得出結論為真正的融合子。

4 存在的問題與展望

4.1 存在的問題

原生質體的制備及再生是原生質體融合技術的前提與基礎，不同種類的食用菌制備條件各不相同，因此，不同種類的食用菌必須嚴格篩選、制備和再生的條件。食用菌原生質體融合可通過生物、化學、物理等方法，但生物融合法存在一定的不安全性、融合率低、操作較復雜，未在食用菌原生質體融合領域應用[29-30]；化學融合法中聚乙二醇作為促融劑不好把握原生質體聚集成團的程度，還會對原生質體產(chǎn)生一定毒性，從而影響原生質體的再生率和融合率[32]；物理融合法具有可控制融合條件、無毒害、操作簡單易行、融合效率高且融合子成活率高等優(yōu)點[27]，應大力推廣安全、無毒、易操作的物理融合法。 目前雖然有多達上百種食用菌原生質體制備與再生方法的報道，但能融合形成穩(wěn)定融合子的種類并不多，能投入實際生產(chǎn)的少之又少。

4.2 展望

原生質體融合技術為食用菌育種提供了有效的方法與手段，以原生質體的制備及再生為前提，通過生物、化學、物理等方法進行原生質體融合，通過生物法、分子標記法相結合對融合子進行鑒定，可實現(xiàn)品種改良、新品種選育特別是野生種馴化等。

雖然食用菌原生質體育種研究較晚，但發(fā)展迅速，由于原生質體融合技術使食用菌在跨種、跨屬、跨科甚至更高分類層次上的雜交成為可能，同時原生質體融合技術具有遺傳信息傳遞量大、技術難度小、設備要求簡單、成本低廉、未知雙親遺傳背景等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景。