周 密 谷涌泉

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院血管外科/首都醫(yī)科大學血管外科研究所/首都醫(yī)科大學血管外科學系，北京 100053

血栓閉塞脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）也稱為Buerger’s病，是一種以手和腳的中小動脈和靜脈反復進行性炎性反應(yīng)和血栓為特征的非動脈粥樣硬化的節(jié)段性、炎性動脈狹窄或閉塞疾病。TAO發(fā)病原因尚不清楚，在有吸煙史的男性中最常見，TAO的截肢率和致殘率極高[1]。但研究表明，TAO的發(fā)展與吸煙、營養(yǎng)失調(diào)、自身免疫、內(nèi)皮細胞活化等有關(guān)，目前主要治療方法包括鼓勵戒煙、避免被動吸煙、藥物治療、運動療法、常規(guī)血運重建、患肢保暖、交感神經(jīng)切除術(shù)和疼痛控制[2]。但在嚴重的缺血性潰瘍和靜息痛患者中，積極的手術(shù)治療并不能延緩患者的病情進展及改善預后，因此，可以嘗試使用其他治療方法。干細胞療法是通過注射細胞而進行的試驗性療法，這些細胞能夠形成新生血管，改善局部循環(huán)并有助于潰瘍的愈合，緩解靜息痛[3-7]。成體干細胞的細胞來源主要包括骨髓干細胞、外周血干細胞（peripheral blood stem cell，PBSC）等，其中骨髓干細胞是目前應(yīng)用最多的細胞來源；用于治療缺血患肢細胞移植的細胞主要有間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）等，但部分無法耐受取骨髓手術(shù)的患者可以經(jīng)細胞動員后從外周血中獲取干細胞后進行細胞移植。本文從干細胞移植治療TAO的機制和臨床常用的骨髓干細胞移植、PBSC移植、脂肪組織間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ATMSC）移植和標記干細胞移植等方面綜述干細胞移植治療TAO的有效性和安全性的進展。

1 干細胞治療TAO的機制

干細胞移植后可以通過多種分子生物學機制改善組織修復和促進血管新生。Mathiyalagan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，向小鼠缺血后肢注射人CD34+細胞來源的干細胞外泌體可通過促進內(nèi)皮細胞攝取微小核糖核酸-126-3p（microRNA-126-3p，miRNA-126-3p）來抑制SPRED-1基因表達，同時上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素1、血管生成素2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，從而改善肢體灌注。源自內(nèi)皮克隆形成細胞（endothelial colony forming cell，ECFC）的細胞外囊泡可以通過與α4和β1整合素的相互作用整合到內(nèi)皮細胞中，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的產(chǎn)生和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑相關(guān)的信使RNA（messenger RNA，mRNA）的轉(zhuǎn)運來刺激血管生成。同樣，MSC來源的外泌體可以通過調(diào)控血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Wnt通路及核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）蛋白的轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能[9]，還可以通過下調(diào)微小核糖核酸-31（microRNA-31，miRNA-31）來抑制缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）的作用[10]，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的功能，MSC可以通過旁分泌途徑分泌大量生長因子和細胞因子，這些因子可以促進新血管的形成和受損組織的重塑。除此之外，干細胞移植還可以通過定向分化為EPC促進新生血管形成及分泌生長因子等調(diào)節(jié)血管新生，具體的分子機制復雜，需要進一步深入探究。

2 骨髓單個核細胞移植

骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）包括造血祖細胞、淋巴樣細胞、單核細胞、EPC和非造血譜系細胞。這些細胞被大量細胞因子和生長因子募集到受損組織中，引發(fā)抗炎作用并減少纖維化，從而防止細胞凋亡。在局部缺血的肢體模型中，自體BM-MNC的局部注射可增強血管生成和側(cè)支血管形成[11]。通過直接注射BM-MNC可以通過分泌血管生成生長因子和細胞因子來增加毛細血管水平的新生血管形成，同時對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生旁分泌作用，從而改善了缺血組織的血液供應(yīng)。而缺血性組織無法募集修復所需的細胞，當注射BM-MNC后，隨著側(cè)支成熟和穩(wěn)定，缺血組織的血供得到改善，從而促進潰瘍和截肢傷口的愈合。Tateishi-yuyama等[5]報道重癥肢體缺血（critical limb ischemia，CLI）患者的干細胞療法顯示，肌內(nèi)注射BM-MNC的細胞療法可延長無截肢間隔時間，并改善缺血性患肢疼痛、潰瘍大小和無痛步行距離，表明注射BM-MNC是治療CLI的一種安全有效的方法。Idei等[3]比較BM-MNC注射治療外周缺血性疾病（peripheral arterial disease，PAD）患者和TAO患者的療效，發(fā)現(xiàn)BM-MNC移植后4年無截肢率在PAD患者中為48%，在TAO患者中為95%。Matoba等[4]研究也有相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)接受BM-MNC注射的TAO患者有更高的無截肢生存率，同時在TAO診斷后長達10年的隨訪中沒有大截肢，證明干細胞療法的安全性和有效性不低于傳統(tǒng)的血管重建療法，而且TAO患者的干細胞療法比PAD患者更有效。Kondo等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對于CLI的患者，采用自體BM-MNC注射是可行且安全的，特別是對于由TAO或膠原病相關(guān)血管炎引起的CLI患者。Guo等[12]研究總結(jié)了TAO患者長達10年的隨訪結(jié)果，BM-MNC注射的患者10年無截肢生存率為85.3%，而單獨口服阿司匹林的患者10年無截肢生存率為40%，注射BM-MNC后患肢的潰瘍面積、趾肱指數(shù)、經(jīng)皮氧分壓（transcutaneous pressure of oxygen，TcPCO2）和疼痛評分也有明顯改善，但接受BM-MNC注射治療的患者和僅接受阿司匹林的患者之間的踝肱指數(shù)（ankle brachial index，ABI）沒有顯著差異。因此，BM-MNC注射治療可以作為難治性TAO的患者安全、有效的替代治療方案。

3 全骨髓細胞移植

既往研究顯示，治療性血管生成多使用BM-MNC或外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PB-MNC）作為干細胞治療的介質(zhì)。然而，從整個骨髓細胞或外周血細胞中分離PB-MNC非常復雜且價格昂貴，并且容易受到污染，而全骨髓細胞（whole bone marrow stem cell，WB-MSC）中的許多細胞因子也可以通過細胞移植發(fā)揮有效促進新生血管的作用。Franz等[13]研究了肌內(nèi)注射自體WB-MSC治療有癥狀的TAO患者臨床效果，結(jié)果顯示55.6%患者達到臨床改善，43.2%患者經(jīng)血管造影結(jié)果評估得到明顯改善。WB-MSC移植治療后1、3和5年無截肢率分別為91.9%、88.5%和84.6%。Lenk等[14]研究也評價了WB-MSC在TAO中的CLI患者中的臨床應(yīng)用效果，在隨訪6個月時，患者在盧瑟福分級、疼痛評分、平均無痛行走時間和趾肱指數(shù)方面表現(xiàn)出顯著改善，與基線相比，ABI雖然增加，但無顯著性差異，76.5%的缺血性潰瘍表現(xiàn)出了完全或改善的愈合。因此，WB-MSC是一種安全有效的TAO替代或輔助治療方式，可改善CLI患者的臨床結(jié)局。

4 PBSC移植

既往研究表明，EPC可以從成人、小鼠和兔子的外周血中分離出來，而粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）可以增強骨髓細胞向血管內(nèi)皮細胞的分化，也可以動員外周血中CD34+、CD133+和KDR+細胞，并具有分化為EPC的能力，同時也可以動員EPC進入外周血，從而進一步在病理和非病理條件下整合到新生血管中。與BM-MNC移植相比，PBSC移植無需全身麻醉，可重復采集，患者更易接受。Miyamoto等[15]研究通過主要觀察指標（受累肢體的疼痛和冷感）及次要觀察指標（跛行距離、ABI、TcPCO2和皮膚溫度）來評估PBSC移植治療TAO的臨床效果，細胞移植后4周，患肢的疼痛和冷感均有不同程度的改善，疼痛評分和冷感評分比較，差異有統(tǒng)計學意義，同時跛行距離、ABI、TcPCO2和皮膚溫度也得到顯著改善。CD34+干細胞含有EPC，可以分化為缺血組織中的血管內(nèi)皮細胞，從而促進血管生成[4,16-17]。純化的CD34+細胞移植（purified CD34+cell transplantation，PuCeT）在治療CLI中已顯示出良好的短期效果，Heo等[18]研究評估了PuCeT治療血管炎性CLI患者的臨床療效，移植后5年，無大截肢生存率為88.89%，平均無痛行走時間增加，潰瘍愈合率為85.71%，復發(fā)率為11.11%，恢復勞動能力率為65.38%，在治療過程中未觀察到嚴重的不良反應(yīng)。Wan等[19]進行的一項回顧性隊列研究發(fā)現(xiàn)外周血來源的純化CD34+細胞（peripheral blood-derived purified CD34+cell，PCC）移植治療效果與未純化的PBSC類似，PBSC移植后，傷口愈合率、靜息痛、無痛行走時間、ABI、TcPCO2和生活質(zhì)量得到顯著改善。因此，無論是PCC還是PBSC，外周血來源的干細胞移植對于TAO的療效是準確且持久的。

5 ATMSC移植

MSC具有多種功能，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。研究發(fā)現(xiàn)，MSC移植在下肢缺血模型中可以誘導新生血管形成。脂肪組織在人體中豐富并可持續(xù)生成，因此，脂肪組織可以作為MSC的理想組織來源。研究表明，ATMSC具有與骨髓基質(zhì)細胞來源的MSC相似生物學特性[20]。Yamamoto等[21]臨床研究顯示，ATMSC移植6個月后，Wong-Baker面部表情評分得到了顯著性改善，同時明顯增加了患者跛行距離并促進傷口的愈合，但沒有改善患者的最大步行距離和ABI，考慮原因為ATMSC移植后形成許多小側(cè)支動脈，從而增加遠端肢體血供；進一步研究發(fā)現(xiàn)ATMSC在裸鼠后肢局部缺血模型中可促血管生成，主要是由ATMSC衍生的旁分泌因子發(fā)揮作用，包括血管生成和抗凋亡因子。因此，多次肌內(nèi)ATMSC注射是在其他治療方式難以起效的TAO患者中實現(xiàn)治療性血管生成的安全替代方案。

6 標記干細胞移植

多項研究表明，更均質(zhì)、純化標記干細胞移植可以增加“活性”細胞比例，從而改善缺血肢體的灌注。Fang等[22]使用PCC移植治療CLI，截肢率更低。醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是干細胞中保守的一種氧化酶，有研究發(fā)現(xiàn)與低ALDH活性的人來源BMMNC相比，靜脈輸注高ALDH活性的人來源BM-MNC后，小鼠的缺血性肢體灌注明顯改善，毛細血管密度明顯增加。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)，高ALDH活性的人來源BM-MNC所 包 含 的CD34+、CD133+、CD14+和CD117+（c-kit+）細胞比例更高[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)接受高劑量的CD34+的PBSC移植治療缺血性肢體，截肢率明顯降低，而CD34+低劑量組截肢率為43%，安慰劑組截肢率達75%，截肢率降低與CD34+的PBSC的數(shù)量相關(guān)[24-25]。RESTORECLI試驗移植了自體“組織修復細胞”，該細胞由擴增的CD90+MSC和CD14+細胞組成，肌內(nèi)注射后1年無截肢生存率增加[26]，因此純化標記干細胞移植可能是治療TAO更好的選擇。

7 其他類型的干細胞移植

與其他來源的干細胞相比，人臍帶血間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）免疫原性低，易于體外擴增，Szoke等[27]研究發(fā)現(xiàn)，UC-MSC移植后24 h，血清腫瘤壞死因子α和白細胞介素-6水平顯著升高，表明UC-MSC具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，可以促進傷口的愈合。Gupta等[28]研究證明UC-MSC移植是治療動脈硬化及TAO導致的CLI有效治療手段。Powell等[29]研究發(fā)現(xiàn)，給予TAO患者注射骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stromal cell，BM-MSC）可以明顯減輕靜息痛，促進潰瘍愈合，提高ABI及步行距離，顯示出良好的TAO治療效果。不同細胞類型的干細胞移植治療TAO的臨床效果較好，基因修飾的干細胞移植可能是將來干細胞精準治療的方向。

8 移植適應(yīng)證和移植方法的選擇

患有動脈粥樣硬化的CLI患者與患有TAO的CLI患者相比，其骨髓細胞表現(xiàn)出功能受損和EPC數(shù)量減少。因此，自體干細胞療法對患有TAO的CLI患者更有效。但是干細胞移植療法的效果與缺血程度有關(guān)，Gao等[30]的研究證明，與盧瑟福分級為4～5級患者相比，盧瑟福分級為6級患者對干細胞療法無反應(yīng)。自體干細胞移植可能在下肢缺血性疾病的早期階段更有效，如在間歇性跛行的患者中療效更佳[31]。因此，對于無條件進行血運重建或血運重建失敗的TAO患者，盡早進行干細胞移植能夠使患者能夠獲得更好的預后。在干細胞移植方法的選擇上主要有經(jīng)動脈給藥和肌內(nèi)注射。相關(guān)研究證實，肌內(nèi)注射后干細胞的存活率和滯留性較差，無法整合到移植患者的血管組織中[31]，PROVASA試驗研究了動脈內(nèi)注射BM-MNC治療缺血性肢體的效果，證實可以顯著緩解靜息痛，潰瘍的愈合同BM-MNC注射的劑量呈正相關(guān)，但是同安慰劑相比，并沒有降低截肢率，因此將經(jīng)動脈給藥和肌內(nèi)注射結(jié)合可能是更好的給藥方式，有助于降低截肢率[32]。

9 生物安全性

干細胞作為一種具有高度復制和分化潛能的細胞，移植后的致癌風險及免疫和遺傳方面的穩(wěn)定性是需要著重考慮的問題，特別是干細胞移植后細胞增殖的調(diào)控仍然是亟需解決的問題，防止干細胞癌變?nèi)匀皇潜ＷC患者移植安全性的首要問題，既往研究顯示干細胞的致癌性是由其自身特性和培養(yǎng)環(huán)境決定的，雖然干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的研究中尚無細胞癌變的相關(guān)報道，但是其致癌風險仍不能忽視，需要國內(nèi)外相關(guān)部門對干細胞移植的整個流程制定統(tǒng)一的標準和完整的體系，從而規(guī)范干細胞的制備和移植，保證干細胞移植的生物安全性。另外，PBSC移植在G-CSF動員后，會有大量的BM-MNC入血，同時促進血小板的聚集活化，不僅顯著增加了血液黏度，同時也提高了血栓形成的風險，需要輔助以規(guī)范的抗凝治療，目前干細胞移植治療TAO的相關(guān)研究均無嚴重不良事件發(fā)生[12,14-15,18,32-34]，是安全且具有光明前景的治療手段。

綜上所述，干細胞治療TAO具有良好的有效性和安全性。各種干細胞來源的移植治療TAO均可以促進缺血患肢的毛細血管新生，增加側(cè)支循環(huán)的建立，改善患肢微循環(huán)，增加缺血組織灌注，促進創(chuàng)面愈合，降低截肢率，改善患者生活質(zhì)量。需要權(quán)衡患者的身體條件、病變特點、經(jīng)濟負擔等因素綜合考慮，制定個體化的干細胞移植方案，從而提高干細胞療法治療TAO臨床療效。