朱 慧 俞光巖

作者單位：100081 北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科（俞光巖為通訊作者）

口腔癌是最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）約占90%。盡管外科手術(shù)、放化療等治療方式不斷進(jìn)步，OSCC 的5 年生存率徘徊在60%左右，未見(jiàn)顯著提高[1]，重要原因是2/3 以上的患者在初診時(shí)已屆腫瘤晚期。

唾液中含有多種與OSCC 相關(guān)的生物標(biāo)志物，與血漿的成分常具有平行性[2]。高通量和高靈敏度檢測(cè)方法的出現(xiàn)解決了唾液中生物標(biāo)志物濃度較低的問(wèn)題。唾液與口腔癌病變部位直接接觸，癌瘤表面壞死的細(xì)胞可直接脫落進(jìn)入口腔，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體或其他分子也可以通過(guò)主動(dòng)、被動(dòng)運(yùn)輸?shù)韧緩綕B入唾液，且唾液易于收集、無(wú)侵入性，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病變化，從而使唾液檢測(cè)成為高效的OSCC 早期診斷的篩選工具[3]。

本文通過(guò)對(duì)PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，收集近五年的研究性文獻(xiàn)，聚焦循環(huán)腫瘤DNA、細(xì)胞外囊泡和循環(huán)腫瘤細(xì)胞，綜述相關(guān)研究的最新進(jìn)展。

一、循環(huán)腫瘤DNA（circulating cell-free tumor DNA，ctDNA）

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生理細(xì)胞更新或特定病理狀態(tài)下，凋亡、焦亡、壞死細(xì)胞或活細(xì)胞釋放入循環(huán)中的DNA[4]。正常狀態(tài)下，cfDNA 會(huì)被吞噬細(xì)胞降解。但在癌癥患者中，此機(jī)制受損，導(dǎo)致cfDNA 在體液中累積[5]。由腫瘤細(xì)胞釋放的DNA 稱ctDNA，可反映腫瘤DNA 甲基化、點(diǎn)突變和微衛(wèi)星改變等變化[6]，與病變組織的遺傳學(xué)改變相關(guān)[2]。ctDNA 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不明確。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可能是正常細(xì)胞內(nèi)化包含ctDNA 的囊泡，或直接接受循環(huán)中由原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞主動(dòng)釋放的ctDNA 后形成的[7，8]。因此，ctDNA 很可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的媒介。

ctDNA 的水平可以反映腫瘤負(fù)荷、進(jìn)行預(yù)后判斷及監(jiān)測(cè)腫瘤切除術(shù)后腫瘤是否有殘留和復(fù)發(fā)。一般來(lái)說(shuō)，ctDNA 的水平與病變所處時(shí)期呈正相關(guān)，且隨疾病進(jìn)展而迅速增加，并在成功的治療干預(yù)后降低[9]。Desai 等[10]對(duì)比44 例口腔癌、40 例口腔癌前病變患者、40 例無(wú)口腔病變吸煙者和40 例不吸煙的健康對(duì)照者血漿的cfDNA 水平，發(fā)現(xiàn)口腔癌組的總cfDNA 水平更高，且總cfDNA 水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.001） 和臨床分期（P＝0.006） 呈正相關(guān)。Mazurek 等[11]對(duì)200 例頭頸鱗癌患者血漿的總cfDNA 水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，腫瘤患者的cfDNA 水平增加，口咽癌患者增加更為顯著。Lin 等[5]的結(jié)果也支持了血清cfDNA 水平越高，OSCC 患者的預(yù)后越差這一觀點(diǎn)。cfDNA 的水平會(huì)受炎癥、吸煙、免疫等多種因素影響，而ctDNA 更具特異性。雖然ctDNA 主要釋放入血液，但可以通過(guò)唾液腺的超濾作用、局部病灶主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸?shù)榷喾N途徑在唾液中富集[12]。唾液中富含來(lái)自口腔腫瘤的DNA，而血清則富含來(lái)自其他部位腫瘤的DNA[13]。因此，在口腔癌中，唾液ctDNA 檢測(cè)的敏感性高于血清[13]。Wang 等[13]報(bào)告，口腔癌患者唾液中ctDNA 的檢出率為100%，高于其他部位的頭頸鱗癌患者，且腫瘤復(fù)發(fā)患者的ctDNA 改變先于影像學(xué)改變，這提示唾液ctDNA 檢測(cè)可用于口腔癌的早期診斷和腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。

ctDNA 不僅可作為腫瘤的生物標(biāo)志物，也可以用于腫瘤異質(zhì)性的鑒別[14]。ctDNA 攜帶的遺傳學(xué)改變信息對(duì)口腔癌發(fā)生的分子機(jī)制的研究有重要意義。Schr?ck 等[15]的研究結(jié)果顯示，血清中ctDNA 甲基化的檢測(cè)可有效應(yīng)用于頭頸鱗癌的診斷和患者預(yù)后的評(píng)估。SHOX2 和SPEPT9 兩個(gè)基因甲基化作為腫瘤的生物標(biāo)志物已在649 例頭頸癌患者的前瞻性隊(duì)列研究中得到驗(yàn)證，ctDNA 的甲基化水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和死亡率有關(guān)，且在臨床出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移前即可檢測(cè)到ctDNA 甲基化水平的升高[15，16]。有學(xué)者報(bào)告，OSCC 患者的腫瘤組織及血清中的ctDNA 都存在著微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且與腫瘤分期相關(guān)[17]。ctDNA也被用于腫瘤的耐藥性監(jiān)測(cè)[18]及腫瘤患者對(duì)治療反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)[19]。但ctDNA 在癌前病變患者中的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

二、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）

EVs 可以分為兩類：一類是通過(guò)出芽直接從細(xì)胞膜脫落的微泡，包括直徑約50nm 至1μm 的微囊泡、微粒和大囊泡；另一類是外泌體，大小約30～150nm，由多囊泡體與質(zhì)膜融合時(shí)通過(guò)胞吐作用釋放[20]。在不少研究中，存在著外泌體和EVs 名稱混用的現(xiàn)象，而目前的分離純化技術(shù)可以鑒定不同類型的囊泡，因此有學(xué)者建議使用囊泡亞型名稱以示區(qū)分[21]。研究表明，EVs 通過(guò)表面配體與靶細(xì)胞受體的識(shí)別結(jié)合、內(nèi)吞作用或與質(zhì)膜融合釋放內(nèi)含物等方式，參與細(xì)胞間的信息交流，調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)，介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[22～24]。腫瘤來(lái)源的EVs 還可以通過(guò)免疫抑制和免疫刺激信號(hào)與免疫細(xì)胞交流從而調(diào)控腫瘤的發(fā)展[25]。

有學(xué)者致力于研究EVs 對(duì)腫瘤早期診斷的作用。EVs 富含多種miRNA，通過(guò)直接與鄰近細(xì)胞或經(jīng)血液循環(huán)與遠(yuǎn)處細(xì)胞信息交流調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)及侵襲。miRNA 具有組織特異性，在不同腫瘤中表達(dá)不同，在不同來(lái)源的外泌體中表達(dá)也有差異。與口腔癌相關(guān)、表達(dá)上調(diào)的miRNA有miR-21，miR-455-5p，miR-155-5p ，miR-372 ，miR-373 ，miR-29b ，miR-1246，miR-196a 和miR-181，而表達(dá)下調(diào)的miRNA 有 miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17 和miR-125b[26]。Rabinowits 等[27]報(bào)告，外泌體中miRNA 的表達(dá)模式比循環(huán)游離miRNA 更貼近腫瘤組織中miRNA 的表達(dá)，因此認(rèn)為將外泌體中的miRNA 作為生物標(biāo)志物信度更高。通過(guò)檢測(cè)唾液外泌體中差異表達(dá)的miRNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)口腔癌的早期診斷。但是目前沒(méi)有明確的、可用于臨床檢測(cè)的miRNA 分子，對(duì)唾液來(lái)源的腫瘤外泌體的內(nèi)含物的研究報(bào)道也較少。

miR-21 是研究較多的生物標(biāo)志物，在OSCC 患者的外泌體中表達(dá)增高。Li 等[28]的研究結(jié)果顯示，低氧微環(huán)境可以刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生富含miR-21 的外泌體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。Liu[29]和Chen 等[30]的研究均顯示EVs 介導(dǎo)的順鉑耐藥性與miR-21 有關(guān)。miR-21 與促炎促腫瘤微環(huán)境的建立密不可分。Momen-Heravi 等[31]報(bào)告，單核細(xì)胞攝取富含miR-21的EVs 后，激活NF-κB 途徑，增加白細(xì)胞介素-6、趨化因子CCL-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 等促炎因子的表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥過(guò)程和腫瘤發(fā)展。陳瑩[32]的研究結(jié)果顯示，OSCC 患者血液和唾液來(lái)源的EVs 中，miR-21-5p 的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，呈正相關(guān)（R2＝0.6951），Pearson 相關(guān)性為0.834（P＜0.05），且OSCC患者唾液EVs 中miR-21-5p 的表達(dá)水平在術(shù)后顯著降低，可以用于預(yù)后判斷。Dioguardi 等[26]對(duì)miR-21 用于口腔癌的早期診斷進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析，其靈敏度為0.771（95%CI 0.680～0.842）（P＜0.001），而特異性為0.663（95%CI 0.538～0.770）（P＜0.001），均顯示了miR-21 作為口腔癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的可能性。Langevin 等[33]對(duì)體外培養(yǎng)的頭頸鱗癌4 種細(xì)胞系中分離出的外泌體進(jìn)行了miRNA 測(cè)序，篩選其中最廣泛表達(dá)的miRNA并在患者唾液中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，miR-486-5p與miR-10b-5p 在患者和健康對(duì)照組唾液的外泌體中存在差異表達(dá)，但敏感度較低。Gai 等[34]分析5 例OSCC 患者和5 例健康對(duì)照者唾液外泌體的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p 和miR-517b-3p 僅在OSCC 患者中表達(dá)，而miR-512-3p 和miR-412-3p在OSCC 患者中呈現(xiàn)高表達(dá)。He 等[35]提出，唾液外泌體中miR-24-3p 是OSCC 潛在的新型腫瘤診斷生物標(biāo)志物。此外，長(zhǎng)非編碼RNA 在OSCC 早期診斷中也有重要意義，但尚未見(jiàn)EVs 中長(zhǎng)非編碼RNA與OSCC 關(guān)系的報(bào)道[36]。

唾液中的微囊泡也可用于OSCC 的早期診斷。Zhong 等[37]純化并定量分析了65 例OSCC 患者唾液中的微囊泡，并以21 例口腔潰瘍患者和42 例健康志愿者做對(duì)照。結(jié)果顯示，OSCC 患者唾液中的微囊泡水平顯著升高，唾液微囊泡水平與OSCC 患者的存活率呈負(fù)相關(guān)，提示其可能是OSCC 惡性進(jìn)展的標(biāo)志物。

三、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）

CTCs 是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血液循環(huán)中的細(xì)胞，攜帶多數(shù)與原發(fā)灶相同的突變譜，參與腫瘤自種植，極有可能是癌癥轉(zhuǎn)移的“先鋒”[38]。在癌癥患者的血液中，CTCs 可以有單細(xì)胞或細(xì)胞簇兩種形式[39]。CTCs 細(xì)胞簇具有免疫逃逸的能力，可以更快地形成種植性腫瘤，在血液中存在的時(shí)間短而不易被檢測(cè)到[39]。Oliveira-Costa 等[40]研究OSCC 患者的基因表達(dá)譜，在對(duì)CTCs 的分析中觀察到，PD-L1，HOXB9 和ZNF813 表達(dá)增高，BLNK 的表達(dá)降低，這一結(jié)果與原發(fā)腫瘤的基因表達(dá)譜相符。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，CTCs 的水平與口腔癌患者生存率和治療效果相關(guān)[41，42]。對(duì)CTCs 表面藥物分子靶點(diǎn)的研究可能有助于精準(zhǔn)免疫治療藥物的研發(fā)[3]。

CTCs 主要根據(jù)其分子大小和生物學(xué)特性（表面的蛋白質(zhì)標(biāo)志物）而被分離出來(lái)，但與良性上皮細(xì)胞不易區(qū)分[2]。在CTCs 檢測(cè)技術(shù)中，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)在臨床使用的是Cell Search 系統(tǒng)，CTCs 對(duì)上皮細(xì)胞黏附分子抗體及細(xì)胞角蛋白8，18 和19 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD45 呈陰性表達(dá)，但此法可能會(huì)丟失CTCs 細(xì)胞簇，導(dǎo)致血液中實(shí)際CTCs 的總數(shù)偏低[43，44]。無(wú)標(biāo)記慣性微流體途徑（label-free inertial microfluidics approach，LFIMA）克服了這一缺點(diǎn)。Kaoro 等[45]提出采用新一代測(cè)序技術(shù)結(jié)合LFTMA 檢測(cè)CTCs 和ctDNA，結(jié)果顯示，組合分析CTCs 和ctDNA 可以擴(kuò)展液體活檢所揭示的基因組譜變化的范圍。Morgan等[46]報(bào)告了一種新的方法，即表面增強(qiáng)拉曼光譜散射納米技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了CTCs 的精準(zhǔn)檢測(cè)。

CTCs 檢測(cè)雖然在腫瘤監(jiān)測(cè)、分子靶向治療、藥敏實(shí)驗(yàn)等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但其精確性和對(duì)臨床的指導(dǎo)作用有待提高。這依賴于精確的分析技術(shù)和生物信息學(xué)工具的利用[47]。目前的研究多限于血樣分析，唾液中是否存在主動(dòng)釋放的腫瘤細(xì)胞尚未可知。