郭琳 徐悅 李玉澤 張東東 黃文麗 鄧翀 張麗 宋小妹,3 宋蓓

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

盤龍七，“太白七藥”之一，別名石白菜、地白菜等，其基原為虎耳草科巖白菜屬(Bergenia)植物秦嶺巖白菜BergeniascopulosaT.P.Wang的干燥根莖，在國(guó)內(nèi)主產(chǎn)于陜西、甘肅、四川等地，在陜西境內(nèi)主要產(chǎn)于眉縣、翠華山以及秦嶺山區(qū)[1-3]，一般生長(zhǎng)在海拔2500～3600 m的濕潤(rùn)的峭壁懸崖縫隙中，為我國(guó)特有種[4-6]。盤龍七味澀、微苦，性平，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、止血、祛痰止咳、補(bǔ)益脾胃、收澀固腸、利水活血、活血化瘀、祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效，臨床上用于治療急慢性腸胃炎、咳嗽、吐血、便血、腸炎、浮腫、崩漏、白帶等癥[7]。近年來(lái)有很多學(xué)者對(duì)盤龍七的化學(xué)成分進(jìn)行研究，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道含有黃酮類、多酚類、香豆素類、蒽醌類、甾體及有機(jī)酸類等[7-11]。巖白菜素作為盤龍七的主要藥效成分，口服無(wú)毒，具有良好的止咳、祛痰、抗菌、抗心律失常、抗氧化和提高免疫力等作用，在臨床上廣泛應(yīng)用于慢性支氣管炎、慢性胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍等疾病的治療[12-17]。另外，盤龍七多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗凝血等作用，且對(duì)機(jī)體毒副作用小[18-20]。近年來(lái)的臨床實(shí)驗(yàn)表明，在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性氣管炎方面，盤龍七具有一定的療效，還能增強(qiáng)免疫功能[21]。本文從原植物形態(tài)、性狀特征、顯微特征等方面對(duì)盤龍七進(jìn)行研究，建立了其薄層色譜鑒別方法及HPLC含量測(cè)定方法，為補(bǔ)充及完善盤龍七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。

1 材料

顯微鏡DMBH200(寧波舜宇儀器有限公司)；微型計(jì)算機(jī)(型號(hào)：?jiǎn)⑻霱430E；批號(hào)：P560A2717044；北京聯(lián)想有限公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵，柱溫箱，2998PDA檢測(cè)器)；微型計(jì)算機(jī)(型號(hào)：?jiǎn)⑻霱4500-M00)；101-A4型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；GB204電子天平(瑞士梅特勒托利多)；舒美KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司)；KEWE電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司)；DYF-200A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

巖白菜素(批號(hào)：HA06214198)、兒茶素(批號(hào)：HC019123198)，蘆丁(批號(hào)：100080-200306)以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%，沒(méi)食子酸(實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)高相液相色譜按面積歸一化法測(cè)定其純度均大于98%)；甲醇為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈純凈水。

盤龍七15批藥材中14個(gè)均采自陜西，只有一個(gè)批次采自甘肅。經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為虎耳草科巖白菜屬(Bergenia)植物秦嶺巖白菜BergeniascopulosaT.P.Wang的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1植物形態(tài) 秦嶺巖白菜為多年生草本，高5～50 cm。全株平滑無(wú)毛。根莖粗壯，延伸，直徑2.5～4 cm，沿石壁縫隙匍生，半暴露；密被栗黑色鱗片和葉柄鞘的殘余。葉基生，葉柄長(zhǎng)1.5～13 cm，托葉鞘無(wú)毛；葉片近肉質(zhì)，有光澤，圓形或?qū)捖褷顖A形，長(zhǎng)5～25 cm，寬3～22 cm，先端鈍圓，基部近圓形或略作楔形，邊緣具鋸齒或不明顯齒，有時(shí)近全緣，兩面具腺窩；葉脈明顯。花莖長(zhǎng)10～20 cm，光滑，中部以上具1披針形苞葉；圓錐狀聚傘花序頂生，具多數(shù)花，分枝，幾先葉開(kāi)放；花萼鐘狀，5深裂，紫紅色，多脈，花瓣5，有深紫色脈紋，先端鈍，基部有爪；雄蕊10，子房卵球形，無(wú)毛，基部2室，花柱2，柱頭大，盾狀。蒴果2瓣裂?；ㄆ?～5月，果期7～8月。(圖1)

圖1 盤龍七原植物——秦嶺巖白菜

2.2藥材性狀 根莖近圓柱形，略彎曲，一端稍細(xì)，直徑0.6～4 cm。表面灰棕色至黑褐色，具密集或疏而隆起的環(huán)節(jié)，密被褐色鱗片及殘存葉鞘，并可見(jiàn)棕紅色細(xì)根痕。質(zhì)堅(jiān)硬，難折斷，斷面棕紅色，略顯粉性，近邊緣處有一圈維管束環(huán)列。氣微，味微苦。(圖2)

圖2 盤龍七藥材圖

2.3顯微鑒別 本品粉末為淺褐色、棕紅色或淺棕色。淀粉粒眾多，均為單粒，類圓形、類橢圓形或梨形，臍點(diǎn)和層紋不明顯；含眾多草酸鈣簇晶和少許草酸鈣柱晶；導(dǎo)管微木化，多為網(wǎng)紋導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管和梯紋導(dǎo)管，有較少環(huán)紋導(dǎo)管和孔紋導(dǎo)管；木栓細(xì)胞表面觀多邊形，薄壁細(xì)胞類橢圓形；含有少量纖維束和較多棕色塊。(圖3)

2.4薄層鑒別 精密稱取盤龍七粉末約1.0 g，加甲醇25 mL，超聲提取45 min(功率250 W，頻率60 kHz)，濾過(guò)，殘?jiān)舆m量甲醇沖洗，濾液定容至25 mL，作為供試品。另取巖白菜素、兒茶素、沒(méi)食子酸加甲醇制成1.5 mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶液6 μL，對(duì)照品溶液巖白菜素、兒茶素、沒(méi)食子酸分別為6 μL、2 μL、2 μL點(diǎn)于同一薄層層析硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶0.9∶0.1)下層液作為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，碘熏，置于日光下觀察。可見(jiàn)供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果如圖所示(圖4)。

1.兒茶素(catechin)；2.巖白菜素(pbergenin)；3-14樣品(sample)：3.陜西太白山(Mountain Taibai of Shaanxi)；4.陜西紅河谷(Red River of Shaanxi)；5.陜西太白山(Mountain Taibai of Shaanxi)；6.陜西眉縣(Mei County of Shaanxi)；7.甘肅隴南(Longnan city of Gansu)；8.陜西漢中(Hanzhong County of Shaanxi)；9.陜西紅河谷(Red River of Shaanxi)；10.陜西眉縣((Mei County of Shaanxi)；11.陜西紅河谷(Red River of Shaanxi)；12.陜西紅河谷(Red River of Shaanxi)；13.陜西太白山(Mountain Taibai of Shaanxi)；14.陜西紅河谷(Red River of Shaanxi)；15.沒(méi)食子酸(gallic acid)

2.5含量測(cè)定

2.5.1色譜條件 色譜柱為Thermo HyPURITY C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈(A)-水溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，5%A～11%A；12～15 min，11%A～15%A；15～20 min，15%A～16%A；20～25 min，16%A～16%A；25～28 min，16%A～19%A；28～34 min，19%A～19%A；34～45 min，19%A～20%A)。

2.5.2對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取巖白菜素、兒茶素、蘆丁的對(duì)照品適量，加甲醇分別制成0.325 mg·mL-1、0.275 mg·mL-1、0.275 mg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.5.3供試品溶液制備 精密稱取盤龍七粉末約0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率60 kHz)45 min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足重量，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液，即得。

2.5.4專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.5.2”、“2.5.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。分離度大于1.5，說(shuō)明基線分離良好。

圖5 對(duì)照品(A:巖白菜素、B：兒茶素、C：蘆丁)及樣品(D：盤龍七)的HPLC色譜圖

2.5.5線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇溶液依次稀釋，分別進(jìn)樣10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定巖白菜素、兒茶素、蘆丁的峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量(X，μg)為橫坐標(biāo)，得回歸方程和線性范圍，同時(shí)以儀器的信噪比S/N為3時(shí)測(cè)定檢出下限(LOD)，S/N為10時(shí)測(cè)定定量下限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系

2.5.6精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定巖白菜素、兒茶素、蘆丁峰面積的RSD分別為1.84%、1.65%、1.04%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.5.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液于0、2、4、8、12、18、24 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定巖白菜素、兒茶素峰、蘆丁峰面積的RSD分別為1.12%、1.08%、1.47%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，平行稱取6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定巖白菜素、兒茶素、蘆丁峰面積的RSD分別為1.87%、1.49%、1.82%，結(jié)果表明本法具有較好的重復(fù)性。

2.5.9加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品粉末約0.25 g，共6份，精密加入對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法操作。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率。結(jié)果巖白菜素、兒茶素、蘆丁的平均回收率及RSD分別為99.74%(0.42%)、99.21%(1.15%)、99.33%(1.01%)。

2.5.10樣品含量測(cè)定 取15個(gè)不同產(chǎn)地的盤龍七樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定(mg·g-1，n=3)

3 討論

盤龍七始載于《陜西中草藥》，在《秦嶺巴山天然藥物志》《華山藥物志》《中藥大辭典》等均有記載。本文從植物形態(tài)及藥材性狀，結(jié)合多次在陜西、甘肅等地進(jìn)行產(chǎn)地調(diào)查，“盤龍七”為虎耳草科巖白菜屬植物秦嶺巖白菜BergeniascopulosaT.P.Wang的干燥根莖，古今所用品種一致。

3.1薄層色譜展開(kāi)劑的選擇 在進(jìn)行盤龍七中巖白菜素、兒茶素、沒(méi)食子酸的鑒別時(shí)，分別考察了三氯甲烷-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-甲酸、三氯甲烷-甲醇-丙酮-水等不同展開(kāi)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終選用三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶0.9∶0.1)下層溶液作為展開(kāi)劑，碘熏后，具有分離度好、斑點(diǎn)清晰等特點(diǎn)，可用于盤龍七藥材的鑒定。

3.2含量測(cè)定檢測(cè)條件的選擇 通過(guò)考察不同比例甲醇-水、乙腈-水對(duì)盤龍七化學(xué)成分的分離效果，結(jié)果顯示使用乙腈-水溶劑的分離效果比較理想；另外，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描和對(duì)不同溫度和流速的考察，最終確定檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；流速為1 mL·min-1；乙腈(A)-水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～12 min，5%A～11%A；12～15 min，11%A～15%A；15～20 min，15%A～16%A；20～25 min，16%A～16%A；25～28 min，16%A～19%A；28～34 min，19%A～19%A；34～45 min，19%A～20%A)。

3.3含量測(cè)定結(jié)果分析 結(jié)合圖5及表2可以看出，巖白菜素含量在盤龍七中最高，兒茶素和蘆丁的含量相差不大，15批盤龍七中3個(gè)成分的含量整體上符合上述規(guī)律，但不少樣品中個(gè)別成分(指含量相近的成分)的含量并不完全遵循上述規(guī)律。另外，我們可以看出各地巖白菜素的含量差異較大，含量最高的樣品和含量最低的樣品相差11.6倍，這可能是由于采摘年份和產(chǎn)地不同造成的影響。由表2中可以看出，陜西紅河谷和眉縣所產(chǎn)的盤龍七所含的巖白菜素含量穩(wěn)定，但紅河谷產(chǎn)盤龍七中巖白菜素的含量較高，可能是由于秦嶺紅河谷的土壤、降水、氣候等因素適合盤龍七的生長(zhǎng)，因此，選擇合適的產(chǎn)地尤為重要，也為臨床用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

盤龍七作為“太白七藥”之一，在民間使用悠久，具有廣泛的藥用價(jià)值，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，有待進(jìn)一步提高，本研究建立的薄層色譜鑒別方法，可以看出15批藥材成分一致，穩(wěn)定，能用于鑒別盤龍七藥材。本論文還建立了盤龍七中巖白菜素、兒茶素、蘆丁的HPLC含量測(cè)定方法。研究結(jié)果表明，本方法薄層斑點(diǎn)清晰，分離度好，含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好，為盤龍七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了科學(xué)依據(jù)。