蒙田秀 袁小玲 梁芳 楊立芳 龔志強(qiáng),

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西 南寧 530003)

目前，藥用植物在控制糖尿病方面使用廣泛，是安全有效的中藥降糖藥物的重要來(lái)源。黃酮類物質(zhì)是很多藥用植物的主要成分，具有很高的藥理活性，能起到抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖等多方面藥理作用[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃酮類化合物對(duì)糖尿病療效明顯，可通過(guò)降低血糖、抑制α-葡萄糖苷酶、保護(hù)胰腺等多途徑來(lái)對(duì)抗糖尿病[2-5]，使其發(fā)病率也明顯降低。

桑寄生(HerbaTaxillus)為桑寄生科植物桑寄生(Taxilluschinensis(DC.)Danser.)的干燥帶葉莖枝[6]，桑寄生主要化學(xué)成分之一為黃酮類化合物，已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)桑寄生原藥材具有抗炎鎮(zhèn)痛，抗痛風(fēng)、降血糖、抗腫瘤等相關(guān)的藥理作用[7-9]。項(xiàng)目組前期開展了桑寄生總黃酮對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖小鼠血糖血脂的影響[10]，表明寄生總黃酮對(duì)高血糖小鼠有很好的降糖作用，其作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)以桑寄生總黃酮(Total FlavonoidHerbaTaxillus，TFHT)為對(duì)象，通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，檢測(cè)TFHT干預(yù)對(duì)小鼠體內(nèi)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用，并測(cè)定血糖含量和相關(guān)代謝酶等指標(biāo)來(lái)探討其降糖作用機(jī)制及對(duì)胰腺的保護(hù)作用，為下一步開發(fā)桑寄生藥用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1儀器與設(shè)備 電子天平(BP211D電子分析天平，德國(guó)賽多利斯)；LG16-W型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn))；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(上海滬瑞明儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1780全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(TECAN)。

1.2藥材與試劑 美國(guó)Sigma公司鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(山東司邦得制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20081230)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201408)、葡萄糖測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20180805137)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)：20180621)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：20180608)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。桑寄生飲片從廣西玉林中藥材市場(chǎng)買進(jìn)，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院黃茂春副教授鑒定為桑寄生科植物桑寄生的干燥帶葉莖枝。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，體重(20±2) g，動(dòng)物合格證：SCXK(桂)2014-0002，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室屏障環(huán)境，所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。溫度：(23±3)℃，相對(duì)濕度(55±15)%，光照12 h明暗交替，自由飲水、進(jìn)食，每周更換滅菌后的清潔墊料。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1TFHT粉末的制備[11]用70%乙醇浸濕桑寄生飲片24 h后減壓回流提取兩次，收集兩次的提取物進(jìn)行濃縮回收乙醇，再低溫濃縮得到浸膏。上D-101大孔樹脂，先除去雜質(zhì)(用20%乙醇洗脫)，再用乙醇進(jìn)行梯度洗脫(30%、40%、50%、60%)，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，烘干粉碎即得到TFHT粉末。

2.2TFHT的含量測(cè)定[12]

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對(duì)照品10.86 mg(批號(hào)：100080-201408，供含量測(cè)定用，按92.8%計(jì)算，中國(guó)食品藥品檢定研究所)，置25 mL量瓶中，加50%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液濃度為0.4344 mg·mL-1。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取桑寄生總黃酮(TFHT)干膏1.0 g，置50 mL量瓶中，加50%乙醇適量，超聲處理30分鐘，放冷，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密量取上述蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL比色管中，各加水至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6分鐘，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6分鐘，加入氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘后，以相應(yīng)的試劑作空白，照紫外-可見分光光度計(jì)法在500 nm處測(cè)定吸光度，以待測(cè)液濃度為X，以吸光度為Y做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果待測(cè)液濃度在17.376～104.256 μg·mL-1范圍內(nèi)和吸光度成良好線性關(guān)系，Y=0.0124X-0.0183，r=0.9992。

2.2.4TFHT含量測(cè)定 精密吸取上述供試品溶液，1 mL置25 mL比色管中(平行試驗(yàn)3份)，同法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果TFHT粉末中桑寄生總黃酮含量為98.99 mg·g-1。

2.3TFHT體外降血糖作用研究

2.3.1測(cè)定TFHT對(duì)α-葡萄糖苷活性的抑制作用[13-14]按照文獻(xiàn)[11]方法，稍作改良。分別取60 μL不同濃度(樣品、阿卡波糖溶液，空白對(duì)照液)待測(cè)液于96孔酶標(biāo)板中，再加入α-葡萄糖苷酶溶液40 μL混勻，放37 ℃15 min水浴，再加入40 μL對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷溶液混勻，再次恒溫水浴反應(yīng)20 min后加入140 μL Na2CO3溶液來(lái)終止酶促反應(yīng)，最后于405 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)?？傸S酮物質(zhì)大多有顏色，所以每個(gè)樣品都要測(cè)定背景吸收，并對(duì)最終的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正[12]。所有樣品均測(cè)3次然后取平均值，按公式(1)計(jì)算抑制率。

抑制率=(1-As/A0)×100%

(1)

式中：AS為樣品吸光度，A0為空白對(duì)照組吸光度。

2.3.2測(cè)定TFHT對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用 按照文獻(xiàn)[15-16]方法，稍作改良。取20 μL各待測(cè)液(阿卡波糖、樣品、空白對(duì)照液)于比色管中，均加入α-淀粉酶溶液100 μL恒溫活化10 min，再加入200 μL底物25 ℃反應(yīng)10 min，最后加入1.0 μL DNS(A液與B液)來(lái)終止反應(yīng)，并在100 ℃沸水中煮沸10 min，向比色管中補(bǔ)充10 mL生理鹽水，冷卻后在分光光度計(jì)540 nm測(cè)吸光度。按公式(1)計(jì)算抑制率。

2.3.3TFHT體內(nèi)降血糖效果研究

2.3.3.1糖尿病小鼠模型的建立 取KM小鼠80只，適應(yīng)養(yǎng)3 d，小鼠不禁水禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(320 mg·kg-1)，72 h后，用血糖儀測(cè)血糖值，選取血糖濃度>11 mmol·L-1的小鼠為合格的糖尿病模型。

2.3.3.2動(dòng)物分組與給藥 將合格的糖尿病小鼠50只按血糖值隨機(jī)分為模型組，二甲雙胍組(60 mg·kg-1)，TFHT高、中、低(600、300、150 mg·kg-1)劑量組，每組10只；另取10只健康的小鼠作為正常對(duì)照組。治療組灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4周，期間正常喂養(yǎng)。在給藥的1、2、3、4周分別眼球取血，分離血清，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。最后取血完脫臼處死，稱取肝臟適量，供肝糖原含量測(cè)定等。

2.4測(cè)定指標(biāo) 開始灌胃給藥前1天(第0周)，各組小鼠禁食不禁水12h后，分別稱重。給藥期間，每周固定時(shí)間稱1次體重，記錄每周小鼠體重的變化。并分別于第0、7、14、21、28天，各只小鼠眼眶靜脈叢取血，分離血清，測(cè)定血糖含量。同時(shí)給藥第4周后，小鼠空腹5 h后一次性灌胃葡萄糖4 g·kg-1，30 min后尾靜脈取血測(cè)定0、0.5、1、2 h的血糖含量，同時(shí)計(jì)算血糖下曲線面積。最后取完血處死小鼠，解剖稱取適量肝臟，供肝糖原含量測(cè)定。按照試劑盒說(shuō)明書，分別測(cè)定小鼠血清血清胰島素水平、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。

3 結(jié)果與分析

3.1TFHT對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 由表1可見，隨著TFHT質(zhì)量濃度的升高，α-葡萄糖苷酶的活性抑制率隨之上升，TFHT濃度增加至2.0 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明TFHT具有顯著降糖能力，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴型的。由表1可知，雖然隨著TFHT質(zhì)量濃度的增加，對(duì)α-淀粉酶的抑制活性也隨之上升，但是抑制率卻遠(yuǎn)低于阿卡波糖的抑制率。從表1可得知，TFHT是一種較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑和較弱的α-淀粉酶抑制劑，并且顯示明顯的劑量依賴性。

表1 TFHT對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制

3.2TFHT體內(nèi)降血糖效果

3.2.1TFHT對(duì)糖尿病小鼠血糖值的影響 由表2可知，模型組的血糖含量明顯高于正常組，經(jīng)過(guò)4周的治療后發(fā)現(xiàn)，模型組糖尿病小鼠的血糖含量是正常小鼠的4.3倍(P<0.001)，經(jīng)過(guò)不同劑量TFHT的治療發(fā)現(xiàn)，治療過(guò)后的糖尿病小鼠的血糖含量顯著降低，各劑量組糖尿病小鼠的血糖含量與模型組相比降低顯著(P<0.05)，且高劑量組小鼠的血糖含量跟二甲雙胍組小鼠的血糖含量在4周后比較相近，結(jié)果說(shuō)明TFHT具有較強(qiáng)的降血糖效果，并體現(xiàn)為劑量依賴性。

表2 對(duì)糖尿病小鼠血糖含量的影響

3.2.2TFHT對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響 由表3可知，TFHT 3個(gè)劑量組小鼠血糖含量均低于模型組，且TFHT中、高劑量組差異非常顯著(P<0.001)。表明TFHT具有明顯降低糖尿病小鼠血糖耐量的作用。

表3 對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

3.2.3TFHT對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響 由圖1可知，模型組含量明顯減少，僅為正常小鼠血清胰島素含量的39%，經(jīng)過(guò)4周的二甲雙胍和TFHT的治療后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，二甲雙胍和TFHT劑量組小鼠血清胰島素含量都有明顯的變化，都明顯高于模型組小鼠的血清胰島素含量，特別是TFHT高劑量組小鼠血清胰島素的含量增加最多。

圖1 TFHT對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響

3.2.4TFHT對(duì)糖尿病小鼠肝糖原含量的影響 在糖尿病小鼠中，肝糖原含量的減少原因主要是因?yàn)橐葝u素含量的缺少和肝糖原的合成受抑制造成，由圖2可知，經(jīng)過(guò)4周的TFHT和二甲雙胍的治療后，胰島素的含量顯著增加，與模型組相比較，正常組小鼠肝糖原的含量是糖尿病小鼠肝糖原含量的2.8倍，TFHT 3個(gè)劑量組小鼠肝糖原含量分別是模型組的2.6、2.0、1.3倍，說(shuō)明TFHT可以從促進(jìn)肝糖原的合成。

圖2 TFHT對(duì)糖尿病小鼠肝糖原含量的影響

3.2.5對(duì)糖尿病小鼠胸腺指數(shù)、SOD、MDA含量的影響 由表4可知。與模型組比較，給藥4周后，二甲雙胍組和TFHT高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.01，P<0.05)，SOD活性亦顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，表面TFHT對(duì)糖尿病小鼠有升高SOD活性，降低MDA含量，保護(hù)胸腺萎縮的作用。

表4 對(duì)糖尿病小鼠胸腺指數(shù)、SOD、MDA含量的影響

4 討論

目前普遍認(rèn)為，導(dǎo)致糖尿病的主要原因是胰島素降低和胰島β細(xì)胞的功能缺陷，而STZ的羥基結(jié)構(gòu)活潑，可直接損傷胰腺β細(xì)胞，甚至誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[17-18]，從而快速升高血糖，所以STZ易造成高血糖模型[19]，同時(shí)也是誘導(dǎo)其它胰島素抵抗相關(guān)，導(dǎo)致的高血糖、血脂異常代謝性動(dòng)物模型，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等[20]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)桑寄生的降糖作用僅有體外降血糖研究，其是通過(guò)加速肝臟的葡萄糖代謝，同時(shí)增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，從而降低血糖水平[21]。羅澤萍[22]近年通過(guò)對(duì)桑寄生醇提物體內(nèi)降糖研究發(fā)現(xiàn)其能明顯降低T2DM模型小鼠的FBG、FINS水平及HOMA-IR值，升高ISI值，表明其具有明顯的降血糖、提高胰島素敏感性及改善胰島素抵抗的作用，其機(jī)制可能與提高小鼠免疫功能、上調(diào)抗凋亡相關(guān)因子、下調(diào)促凋亡及促炎相關(guān)因子的表達(dá)，從而維護(hù)肝細(xì)胞功能狀態(tài)、減輕腎細(xì)胞受損程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外降糖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TFHT有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的作用。進(jìn)而開展體內(nèi)降糖實(shí)驗(yàn)，通過(guò)TFHT對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示各給藥組能明顯降低糖尿病小鼠的血糖值，增強(qiáng)葡萄糖耐受能力，表明糖尿病小鼠胰島素抵抗力得到增強(qiáng)。這可能是桑寄生中的總黃酮物質(zhì)促進(jìn)胰島素大量分泌而使血糖降低。同時(shí)各給藥組小鼠MDA含量顯著降低、SOD活性和胸腺指數(shù)明顯增高，表明TFHT能在一定程度上抑制動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)亦可保護(hù)糖尿病小鼠胸腺萎縮。

綜合本次研究結(jié)果表明，TFHT對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有較好的降糖效果，并通過(guò)抑制小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)糖尿病小鼠胸腺萎縮，但其降糖作用機(jī)制復(fù)雜，可能與TFHT有保護(hù)和修復(fù)胰腺β細(xì)胞，或可改善胰島素抵抗及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等多方面的作用有關(guān)。