胡映秋 王開(kāi)陽(yáng) 扶流祥 吳利東 徐美玲

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，江西南昌 330000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，江西南昌 330000

骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱指的是骶段脊髓病變、腰椎病變引起脊髓損傷導(dǎo)致?lián)p傷骶髓初級(jí)排尿中樞，或者是由于臨近體神經(jīng)與副交感神經(jīng)病變導(dǎo)致的膀胱功能障礙，具體表現(xiàn)包括逼尿肌無(wú)反射，膀胱容量逐漸擴(kuò)大，尿液無(wú)法正常排出[1]。這一膀胱功能障礙使膀胱組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)病理層面的改變，可能繼發(fā)尿路反復(fù)性感染，嚴(yán)重情況下還可能出現(xiàn)腎衰，被認(rèn)為是脊髓損傷病死的主要原因[2]。因此針對(duì)骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留，需要重視改善其尿動(dòng)力學(xué)狀況，提高膀胱功能。中醫(yī)將尿潴留納入“癃閉”范疇，針灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法，被證實(shí)可對(duì)膀胱功能形成雙相調(diào)節(jié)，還能有效抗泌尿系感染[3]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)該病模型大鼠給予電針治療能增強(qiáng)其逼尿肌興奮程度，提高膀胱收縮張力，幫助膀胱排尿功能得以重建[4]。本研究選擇30 只雄性SD 大鼠，分為三組后分析電針治療的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

10%水合氯醛，手術(shù)臺(tái)，微型蚊式鉗，眼科剪，慶大霉素（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H42022058），電針治療儀（安陽(yáng)市翔宇醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司，XYD-Ⅲ型，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：YZB/豫0050-2009），F(xiàn)3 導(dǎo)管，微量灌注泵，多通道生理記錄儀[ADInstruments POWERLAB，藥（械）準(zhǔn) 字：20153212513]，Primer-BLAST，TRIzol 試劑（上海恪敏生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒[金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司，規(guī)格：50T RE0510]，據(jù)蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）[北京庫(kù)爾科技有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：京藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011 第2400737 號(hào)]，5%脫脂奶粉 （石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司），Western 洗滌緩沖液（TBST）（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)：LM-2925）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

材料：選擇30 只健康成年雄性SD 大鼠作為本研究材料，大鼠均為無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)別，體重250～300 g，均采購(gòu)于本地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，有正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證，許可證號(hào)：SYXK（贛）2020-0016。本研究整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均與動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)相符合。

分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法選擇其中10 只作為對(duì)照組，另外20 只建立骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留模型，建模成功后再將這20 只大鼠隨機(jī)分為模型組（10 只）和電針組（10 只）。

1.3 方法

1.3.1 建模 根據(jù)脊髓橫斷法進(jìn)行模型制備，具體操作如下。選擇10%水合氯醛行腹腔注射進(jìn)行麻醉處理，將大鼠放置為俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)。骨性標(biāo)志選定為連接第13 浮肋的T13，向上以此類(lèi)推，完成T10的定位，并進(jìn)行備皮處理，碘伏消毒后于后正中線從T8 到T12作縱向切口。將皮膚切開(kāi)并逐層進(jìn)行鈍性分離處理，將T9到T11共3 個(gè)棘突以及橫突暴露出來(lái)。將橫突通過(guò)鑷子夾住并固定，選擇微型蚊式鉗T10椎板咬除，將2 mm 直徑的脊髓暴露出來(lái)，迅速通過(guò)眼科剪將脊髓剪斷，之后迅速能觀察到大鼠兩下肢有抽搐反應(yīng)，尾巴會(huì)甩動(dòng)，接著會(huì)徹底松弛。止血后將各層按順序關(guān)閉，選擇慶大霉素涂抹傷口。

1.3.2 建模成功標(biāo)準(zhǔn) 建模24 h 之后能觸及膀胱隆起，且脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）評(píng)分[5]結(jié)果為0 分，前肢可行走，后肢處于拖動(dòng)狀態(tài)。本研究20 只大鼠均成功建模。建模后大鼠均保持單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度恒定37℃，予其自由飲水、進(jìn)食，每天按壓其膀胱幫助其排尿以及排便，頻率2～3 次/d，另外每天選擇20 萬(wàn)U 青霉素進(jìn)行腹腔注射進(jìn)行傷口感染預(yù)防，持續(xù)使用1 周。

1.3.3 治療 對(duì)照組不給予治療，模型組不給予治療，電針組以次髎、三陰交以及中極為穴位進(jìn)行針刺治療，穴位定位：次髎穴處于第2 骶后孔部位直刺15 mm 左右，中極穴處于神闕穴與恥骨聯(lián)合上緣連線的上4/5 與下1/5 的交點(diǎn)平刺5 mm，三陰交穴位處于后肢內(nèi)踝尖直上方1 cm 部位直刺5 mm。電針刺激通過(guò)電針治療儀進(jìn)行，疏密波分別設(shè)置為10、50 Hz，相應(yīng)工作5、9 s，以大鼠肢體輕微顫動(dòng)為宜。針刺雙側(cè)次髎穴位時(shí)左側(cè)與正極連接，右側(cè)與負(fù)極連接，針刺中極穴位時(shí)與負(fù)極連接，針刺三陰交穴位時(shí)與正極保持連接，并且進(jìn)行三陰交針刺時(shí)應(yīng)該保持左右側(cè)交替取穴。每天治療1 次，每次治療時(shí)間持續(xù)20 min，持續(xù)治療1 周。

1.4 觀察指標(biāo)

采集及處理標(biāo)本：所有大鼠均在結(jié)束尿動(dòng)力學(xué)檢查后，通過(guò)水合氯醛實(shí)施腹腔麻醉，中心點(diǎn)選定為L(zhǎng)2～L3椎間隙，取其上、下分別1 cm 左右位置的脊髓組織，通過(guò)生理鹽水將取下的脊髓組織清洗干凈，置于-80℃溫度下保存待用。

尿動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)：所有大鼠完成麻醉處理后，將膀胱排空，將F3 導(dǎo)管置入尿道，連接微量灌注泵、多通道生理記錄儀，保持0.1 ml/min 的恒定速度灌注恒溫生理鹽水，將各組大鼠膀胱最大容量、膀胱基礎(chǔ)壓、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性記錄下來(lái)。

PCR 試驗(yàn)：根據(jù)基因庫(kù)（GenBank）中大鼠熱休克蛋白20（heat shock proteins-20，HSP-20）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、BCL2-Associated X 蛋白質(zhì)（BCL2-Associated X protein，Bax）、半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、叉頭框蛋白O1 （forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）、β-actin 的mRNA 序列，通過(guò)Primer-BLAST 完成PCR 引物的設(shè)計(jì)。依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)通過(guò)TRIzol 試劑相應(yīng)提取三組大鼠脊髓組織的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄將RNA 為互補(bǔ)cDNA，繼續(xù)依據(jù)說(shuō)明書(shū)通過(guò)SYBR Green Ⅰ染料法完成定量PCR 試驗(yàn)。PCR 反應(yīng)程序：95℃下進(jìn)行0.5 min 預(yù)變性；94℃變性5 s，60℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min（上述3 個(gè)溫度擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)）；最后72℃下進(jìn)行10 min 延伸。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次，以3 次平均值記錄為最終結(jié)果。

Western blot 試驗(yàn)：稱量50 mg 脊髓組織樣品，勻漿處理，留心處理后留取上層清液，根據(jù)BCA 法說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度，5×Loading buffer 混合均勻，行持續(xù)5 min 的沸水浴。每泳道上樣蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠、濕法轉(zhuǎn)膜，接著浸泡在5%脫脂奶粉中，室溫環(huán)境下靜置1 h 左右。之后把膜、一抗放在4℃冰箱中進(jìn)行過(guò)夜孵育，1×TBST 進(jìn)行3 次清洗，每次清洗持續(xù)10 min。接著選擇1×TBST 稀釋的二抗放在37℃環(huán)境下進(jìn)行1 h 孵育，繼續(xù)用1×TBST 進(jìn)行3次清洗，每次清洗持續(xù)15 min。顯色曝光后掃描底片，對(duì)蛋白灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 23.0 分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組比較采用ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組尿動(dòng)力學(xué)的比較

三組的膀胱順應(yīng)性、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱基礎(chǔ)壓、膀胱最大容量結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、電針組的上述指標(biāo)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組上述指標(biāo)結(jié)果均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)的比較（±s）

表1 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)的比較（±s）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；1 cmH2O=0.098 kPa

對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.09±0.01 0.19±0.02a 0.13±0.01ab 5.462 0.000 38.89±2.21 52.16±4.17a 44.18±3.19ab 6.819 0.000 26.03±2.19 29.73±2.38a 27.15±2.47ab 5.378 0.000 1.18±0.13 4.40±0.36a 2.30±0.21ab 8.814 0.000組別 例數(shù) 膀胱順應(yīng)性（ml/cmH2O）漏尿點(diǎn)壓力（cmH2O）膀胱基礎(chǔ)壓（cmH2O）膀胱最大容量（ml）

2.2 三組大鼠HSP20、PTEN 的mRNA 表達(dá)的比較

三組HSP20、PTEN 的mRNA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平均低于對(duì)照組，PTEN 的mRNA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較（±s）

表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較（±s）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 1.70±0.39 0.68±0.16a 1.22±0.30ab 7.182 0.000 0.86±0.21 2.33±0.56a 1.50±0.35ab 11.057 0.000組別 例數(shù) HSP20 mRNA PTEN mRNA

2.3 三組大鼠Akt 活化及凋亡通路mRNA 表達(dá)的比較

三組Bax、FOXO1、Bcl-2、Caspase-9、Akt 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對(duì)照組，Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組，Bcl-2 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組、模型組Akt 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關(guān)因子mRNA 水平（±s）

表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關(guān)因子mRNA 水平（±s）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.28±0.06 1.31±0.33a 0.94±0.22ab 7.593 0.000 0.92±0.21 2.56±0.63a 1.48±0.37ab 6.832 0.000 1.51±0.33 0.62±0.15a 1.12±0.27ab 7.924 0.000 0.85±0.21 1.67±0.41a 1.19±0.29ab 10.057 0.000 1.06±0.13 1.01±0.11a 1.00±0.10a 3.054 0.019組別 例數(shù) Bax FOXO1 Bcl-2 Caspase-9 Akt

3 討論

中醫(yī)將尿潴留納入“癃閉”范疇，認(rèn)為其發(fā)生是由于腎氣不足，膀胱氣化失司，三焦無(wú)法通調(diào)水道而起[6]。本研究電針組治療選擇的穴位為次髎、中極以及三陰交穴，其中次髎為膀胱經(jīng)穴位，不僅為局部取穴，也是膀胱病變治療的常用穴位。中醫(yī)典籍中有“次髎，主大小便不利”；三陰交穴是足三陰經(jīng)交會(huì)穴，足三陰經(jīng)循行少腹或陰器，有通調(diào)下焦氣機(jī)的作用，可對(duì)膀胱功能起到調(diào)節(jié)作用[7]。中極穴是膀胱募穴，屬于足三陰與任脈之會(huì)，中醫(yī)中六腑病變?nèi)⊙ㄖ委煻嗳〈颂幯ㄎ?，中極穴被認(rèn)為是膀胱病變治療的重要穴位[8]。

從排尿反射神經(jīng)通路這一層面來(lái)看，排尿中樞處在骶叢神經(jīng)，次髎穴下有支配盆腔臟器的骶神經(jīng)，對(duì)這一穴位進(jìn)行針刺治療能將與排尿相關(guān)的傳入與傳出神經(jīng)激活，還能經(jīng)傳入神經(jīng)元向高級(jí)中樞傳導(dǎo)刺激，激發(fā)逼尿肌、膀胱內(nèi)括約肌節(jié)律性收舒運(yùn)動(dòng)，最終建立并完成排尿反射[9]。三陰交穴位下通過(guò)著L4~S3神經(jīng)根的脛神經(jīng)，且深層有L5、S1神經(jīng)節(jié)段，淺層有屬于L4神經(jīng)節(jié)段的隱神經(jīng)，通過(guò)對(duì)這一穴位進(jìn)行刺激治療能經(jīng)反射弧傳至脊髓后根，對(duì)腰骶部排尿中樞有激發(fā)作用，可促進(jìn)反射性排尿[10]。研究對(duì)三陰交、次髎等穴位進(jìn)行針刺治療，顯示患者尿道括約肌舒縮功能、膀胱運(yùn)動(dòng)功能均有明顯改善，同時(shí)膀胱最大容量明顯下降，殘余尿量明顯減少[11-12]。中極穴處在膀胱局部，是支配膀胱、直腸的神經(jīng)分支-髂腹下神經(jīng)，對(duì)這一穴位進(jìn)行針刺治療能對(duì)膀胱產(chǎn)生刺激，促使膀胱逼尿肌收縮，幫助膀胱皺襞能再次皺縮，促進(jìn)排尿反射，生成尿意[13]。研究對(duì)關(guān)元與中極穴進(jìn)行電針治療，顯示電針可經(jīng)自主神經(jīng)刺激傳入神經(jīng)，對(duì)膀胱活動(dòng)形成調(diào)節(jié)，并能幫助恢復(fù)膀胱功能[14-15]。

本研究電針組治療后膀胱最大容量、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性均較模型組明顯下降，接近對(duì)照組水平，提示電針治療能改善脊髓損傷尿潴留患者的排尿中樞功能，促使膀胱逼尿肌彈性提升，能幫助逼尿肌反射逐漸恢復(fù)，并維持正常收縮功能，減低膀胱最大容量，減少殘余尿量，進(jìn)而使膀胱功能得到改善。本研究電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)HSP20 上升、PTEN 下降能提高Akt 活性，表明電針治療對(duì)脊髓損傷尿潴留的作用機(jī)制可能與HSP20、PTEN 水平具有緊密聯(lián)系。另外本研究顯示模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組、電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組，Bcl-2 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組、模型組Akt 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示接受電針治療能提升Akt 活性，并會(huì)對(duì)下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達(dá)產(chǎn)生影響，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。上述結(jié)果表明，骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留會(huì)加快細(xì)胞凋亡，神經(jīng)細(xì)胞受損，因此脊髓、膀胱功能會(huì)受到影響，膀胱排尿功能變得異常，最終引發(fā)尿潴留[16]。通過(guò)實(shí)施電針治療，能加快HSP20表達(dá)，促進(jìn)其磷酸化轉(zhuǎn)變，對(duì)PTEN 表達(dá)產(chǎn)生抑制，并提升Akt 活性，提升下游Bcl-2 水平，對(duì)凋亡因子包括Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達(dá)產(chǎn)生抑制，形成對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，最終幫助恢復(fù)部分脊髓神經(jīng)功能，并使神經(jīng)中樞對(duì)膀胱組織的調(diào)控得以提升，使逼尿肌、括約肌的功能以及膀胱內(nèi)壓維持在正常水平，使膀胱排尿功能、收縮功能得以改善，最終能使尿潴留癥狀逐漸減輕[17-18]。

綜上所述，電針治療骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留大鼠能改善其尿動(dòng)力學(xué)，具體作用機(jī)制考慮與抑制PTEN 表達(dá)、促進(jìn)HSP20 磷酸化與表達(dá)，并進(jìn)一步抑制凋亡通路、提高Akt 活性相關(guān)。