石敏娟 劉家邑 楊蓮芳 劉軍鋒 袁秋貞 李博 甘雪峰 姜姍姍**

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

化濕潤(rùn)女膠囊來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，驗(yàn)之臨床取得了較好療效。主要由茯苓，蒼術(shù)等10味中藥組成，具有健脾利濕，理氣化濁的功效，主要用于脾失健運(yùn)，濕濁壅塞經(jīng)絡(luò)、胞宮，所致的不孕。脾主運(yùn)化，如脾虛不運(yùn)，則痰濕內(nèi)生，胞脈受阻，不能攝精成孕；另一方面脾為氣血生化之源，脾虛則生化無(wú)力，沖任失養(yǎng)，不能養(yǎng)精育胎，故脾虛與不孕癥密切相關(guān)。本研究擬通過(guò)觀察化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)大黃所致脾虛雌性小鼠生殖功能的影響，為臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1藥品及試劑 生大黃制劑的制備：取生大黃1000 g，切片后冷水浸泡24 h，過(guò)濾，40 ℃水浴濃縮成每毫升含生藥1 g[3]；血清促排卵素(FSH)試劑盒、促黃體生成素(LH)試劑盒、雌二醇(E2)試劑盒、孕酮(P)試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物：SPF級(jí)雌性KM小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。

1.3主要儀器 體視顯微鏡:XTL-220，上海光密儀器有限公司；歐姆龍電子體溫計(jì)：MC-106B，歐姆龍工貿(mào)(大連)有限公司生產(chǎn)。

1.4方法 取SPF級(jí)雌性KM小鼠50只，體重約18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(A組)、脾虛模型組(B組)、化濕潤(rùn)女膠囊高(C組)、中(D組)、低(E組)劑量組。除空白組小鼠灌胃去離子水外，其余4組小鼠灌服100%生大黃水浸液30 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)14天造成脾虛模型[1]。從第15天開(kāi)始，空白對(duì)照組與脾虛模型組給予去離子水灌胃10 mL·kg-1，化濕潤(rùn)女膠囊高、中、低劑量組分別灌服化濕潤(rùn)女膠囊2.10 g·kg-1、1.05 g·kg-1、0.525 g·kg-1，每天1次，連續(xù)14天。

觀測(cè)小鼠：①一般情況：觀察小鼠形態(tài)、毛色、活動(dòng)、大便等。②小鼠體重及肛溫：末次給藥前禁食12 h，給藥后0.5 h，稱重、測(cè)定肛溫。③ELISA法檢測(cè)小鼠性激素：測(cè)定完體重和肛溫的小鼠，摘除眼球取血，離心后獲得血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成血清促卵泡素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌激素(E2)、孕酮(P)的檢測(cè)。④性腺指數(shù)和排卵數(shù)：上述實(shí)驗(yàn)取血完畢后處死小鼠，剖取輸卵管、子宮和雙側(cè)卵巢，剝離周圍附著的脂肪組織，稱子宮、卵巢濕重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器濕重/體重×1000。把輸卵管壓片，用體視顯微鏡觀察計(jì)數(shù)每動(dòng)物雙側(cè)輸卵管內(nèi)的卵子數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)脾虛小鼠一般情況的影響 經(jīng)大黃灌服后的小鼠第4天出現(xiàn)少食、懶動(dòng)、便溏等癥狀，第6天出現(xiàn)精神倦怠、毛發(fā)枯燥、蜷縮，消瘦，第10天部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛，與脾虛證臨床表現(xiàn)基本吻合。造模及給藥期間，模型組和小劑量組各有一只動(dòng)物死亡。各治療組小鼠毛色恢復(fù)光澤，活動(dòng)增多，大便成形。

2.2化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)小鼠體重及體溫的影響 造模成功后，模型組的體重及體溫均顯著低于空白組(P<0.01)。化濕潤(rùn)女膠囊高劑量組體重(P<0.01)和體溫(P<0.05)均明顯回升，與模型組比較差異具有顯著性。見(jiàn)表1。

表1 化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)脾虛小鼠體重質(zhì)量及體溫的影響

2.3化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)血清FSH、LH、E2、P的影響 與空白組比較，模型組血清FSH、P(P<0.05)，LH、E2(P<0.01)均降低，中、低劑量組LH、E2均顯著低于空白組(P<0.05)，高劑量組FSH、P、LH、E2均顯著高于模型組(P<0.05)，提示化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)性激素的影響呈劑量依賴性。

2.4化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)小鼠性腺指數(shù)及排卵功能的影響 模型組與空白組及給藥組比較，卵巢顯蒼白，且較小，子宮肌層較薄欠紅潤(rùn)。高劑量化濕潤(rùn)女膠囊可使小鼠子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)增加，和模型對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)；高、中劑量組可使小鼠排卵數(shù)目增加，和模型組比較有極其顯著差異(P<0.01)。

表2 化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)小鼠血清FSH、LH、E2、P的影響

表3 對(duì)小鼠性腺指數(shù)及排卵功能的影響

3 討論

化濕潤(rùn)女膠囊以使用多年的臨床驗(yàn)方為依據(jù)，臨床總有效率86.5%,妊娠率為38.4%，具有健脾利濕，理氣化濁的功效，主要用于脾失健運(yùn)，濕濁壅塞經(jīng)絡(luò)、胞宮，所致的不孕。臨床癥見(jiàn)月經(jīng)后期，量少，色淡、形體肥胖、面色無(wú)華、頭重身困、舌淡胖或有齒痕、脈細(xì)微等。臨床不孕癥大多與精神緊張，工作壓力大以及起居失常、飲食不節(jié)等原因造成腎虛、肝郁或脾虛有關(guān)。以往治療功能性不孕癥多以補(bǔ)腎益精或疏肝理氣之法，但很多時(shí)候效果不甚理想[2]。多位醫(yī)家從臨床經(jīng)驗(yàn)提出脾在功能性不孕中具有重要作用[2-5]，更有學(xué)者提出“助孕先治脾”的觀點(diǎn)[2]。脾為生痰之源，脾虛失運(yùn)，水谷精微輸布障礙，水濕內(nèi)停，聚濕成痰，痰濕阻滯沖任，胞脈阻塞，故見(jiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕。我國(guó)古代多名醫(yī)家對(duì)脾虛導(dǎo)致痰濕和不孕的關(guān)系進(jìn)行論述，《傅青主女科·種子》中言“婦人有身體肥胖，痰涎甚多，不能受孕者。”“而肥胖之濕，時(shí)非外邪，乃脾土之內(nèi)病也?！薄缎ＷD人良方·求嗣門》中總結(jié)不孕癥的常見(jiàn)原因?yàn)椤案`謂婦人之不孕，亦有因六淫七情之邪，有傷沖任……，又有脾胃虛損，不能營(yíng)養(yǎng)沖任”?，F(xiàn)代研究顯示同樣的結(jié)果，用利血平肌注雌性大鼠進(jìn)行脾虛造模，模型大鼠生殖器官萎縮；血清FSH、E2水平下降；子宮腺體數(shù)目、卵巢次級(jí)及成熟卵泡數(shù)減少，生育能力下降[6]。故本病以脾氣虛弱運(yùn)化不利為本，痰濕阻滯沖任胞脈為標(biāo)，治法應(yīng)以健脾利濕為主，兼以通化濁氣，水濕痰邪得化，胞胎得養(yǎng)而成?；瘽駶?rùn)女膠囊以茯苓健脾滲濕為君藥，佐以蒼術(shù)、法半夏加強(qiáng)利濕之功；以皂角刺、蜂房、連翹、白花蛇舌草這類質(zhì)輕之藥解毒通化一身濁氣；莪術(shù)行氣破血加速濁氣排出，推動(dòng)全身氣機(jī)運(yùn)行；再以川楝子入肝行氣、白芥子利氣，通利一身氣機(jī)，諸藥合用共同發(fā)揮健脾利濕，理氣化濁的功效。脾氣健運(yùn)，精、氣、血、津液化生有源，則沖任二脈有血以用，精血得養(yǎng)，溫煦胞宮，月經(jīng)便會(huì)恢復(fù)正常，方可攝精成孕。

苦寒中藥復(fù)制脾虛模型的造模思路，是根據(jù)李時(shí)珍對(duì)大黃“其性苦寒，能傷元?dú)夂年幯奔袄铌健按蠹煽嗪帗p其脾胃”的論述為依據(jù)。常用大黃、芒硝、番瀉葉、玄明粉或大承氣湯等，以水浸泡或煎煮的煎劑灌胃動(dòng)物造模[7]。王曉明等通過(guò)對(duì)脾虛動(dòng)物模型的客觀指標(biāo)研究表明，進(jìn)食、體重、糞便狀態(tài)是評(píng)估脾虛證動(dòng)物模型的基本指標(biāo)[8]。本研究采用生大黃水浸液灌胃造模，模型動(dòng)物出現(xiàn)少食、體重下降、毛發(fā)枯槁、便溏等脾虛癥狀，部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛，說(shuō)明造模成功。

脾主運(yùn)化，如脾的運(yùn)化功能健全，則臟腑、經(jīng)絡(luò)、四肢百骸以及筋肉皮毛等組織能得到充足的營(yíng)養(yǎng)而發(fā)揮正常的生理活動(dòng)。若脾失健運(yùn)，必然影響食物的消化和水谷精微的吸收而出現(xiàn)腹脹、便溏、食欲不振、倦怠、消瘦等病變。大黃苦寒，以其灌胃復(fù)制的脾虛模型以脾氣(陽(yáng))虛為主[9-10]，脾陽(yáng)虛衰，溫煦功能減退，機(jī)體基礎(chǔ)代謝率下降，水液的輸布及氣化出現(xiàn)障礙，出現(xiàn)大便清稀、體溫偏低等寒癥表現(xiàn)。脾虛小鼠經(jīng)化濕潤(rùn)女膠囊治療后，便溏等癥狀明顯改善，從第4天開(kāi)始各給藥組體重明顯回升，明顯高于模型小鼠，接近正常小鼠。而模型組小鼠經(jīng)過(guò)自然恢復(fù)，其體重仍舊顯著低于空白組小鼠，提示化濕潤(rùn)女膠囊能改善脾虛癥狀，促進(jìn)脾虛小鼠體重和體溫的恢復(fù)。

下丘腦-垂體-卵巢軸(HPAA)對(duì)維持女性正常生殖功能具有重要作用。脾為后天之本，化生氣血以充養(yǎng)臟腑，有研究顯示脾虛能引起性激素水平的異常變化[11]，李聰?shù)萚12]研究柴疏四君湯對(duì)肝郁、脾虛和肝郁脾虛模型大鼠性腺軸的影響，發(fā)現(xiàn)脾虛模型存在下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常。FSH是垂體分泌的一種刺激卵泡成熟的激素，具有促進(jìn)生殖細(xì)胞分化和性腺發(fā)育的功能，能促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，干預(yù)主卵泡的募集、選擇、成熟和排卵的過(guò)程[13]。LH也是誘發(fā)排卵的重要激素之一，其通過(guò)和FSH協(xié)同刺激卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育與成熟，影響內(nèi)膜細(xì)胞E2的合成和分泌，參與排卵過(guò)程和黃體的生成過(guò)程，合適的 E2是卵母細(xì)胞成熟和受精卵著床的重要調(diào)節(jié)因素，E2的低值可能導(dǎo)致了不孕癥的發(fā)生[14]。國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者通過(guò)子宮增重實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的雌激素活性[15-19]，化濕潤(rùn)女膠囊能增加脾虛小鼠子宮重量，提高脾虛小鼠的子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)，提示化濕潤(rùn)女膠囊具有類雌激素活性。雌激素主要刺激性生殖系統(tǒng)的發(fā)育，促進(jìn)子宮內(nèi)膜各種成分增殖生長(zhǎng)，為胚胎著床提供良好環(huán)境。P能使增殖的子宮內(nèi)膜及時(shí)轉(zhuǎn)化為分泌型子宮內(nèi)膜，促進(jìn)蛻膜形成和發(fā)育，使子宮內(nèi)膜由非黏附狀態(tài)進(jìn)入黏附狀態(tài)，有利于胚胎著床。這些性激素作用于靶器官，靶器官在性激素的調(diào)控下產(chǎn)生周期性變化，調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟以及排卵，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床，提高受孕率[21-22]。因此測(cè)定血清生殖激素E2、FSH、LH、P含量能直接反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能，是反應(yīng)下丘腦一垂體一卵巢功能軸的重要指標(biāo)?；瘽駶?rùn)女膠囊能提高血清E2、P、FSH、LH水平(P<0.05)，提示化濕潤(rùn)女膠囊能增強(qiáng)垂體的內(nèi)分泌功能，促進(jìn)輸卵管卵泡發(fā)育，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從性腺指數(shù)、排卵功能、性激素水平等方面，觀察了化濕潤(rùn)女膠囊對(duì)脾虛小鼠生殖功能的影響，結(jié)果表明化濕潤(rùn)女膠囊能明顯改善脾虛癥狀，促進(jìn)子宮和卵巢發(fā)育，促進(jìn)排卵，促進(jìn)促性腺激素的合成與釋放，提高子宮內(nèi)膜對(duì)受孕卵的容受性，利于胚胎著床。但其對(duì)雌激素及孕激素受體及蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，為臨床使用提供依據(jù)。