梁桓熙 王子依 李晶哲 馬琰巖 劉長振 孫震曉

摘要 目的：對毛蚶抗癌蛋白（ASAP）進行了分離純化，并研究分離后毛蚶抗癌蛋白主要組分的抗癌作用。方法：依次利用陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析對ASAP進行分離;聯(lián)合p53基因表達激活及CCK-8細胞活力測定檢測分離組分的抗癌活性;CCK-8細胞活力測定法檢測毛蚶抗癌蛋白主要組分對人結(jié)直腸癌Colo205、HT-29、人肺癌A549、人慢性髓性白血病K562細胞活力的影響;Annexin-V/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;Western Blotting法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白：Mcl-1、Bcl-2、Bax、procaspase-3的表達情況。結(jié)果：從ASAP中分離得到的毛蚶抗癌活性蛋白主要組分C6在24～72 h內(nèi)對Colo205、HT-29、A549、K562的細胞活力均有不同程度的抑制作用，其中對Colo205細胞的抑制作用最明顯，作用72 h時IC50為5.7 μg/mL;C6可以誘導(dǎo)Colo205細胞凋亡且呈一定劑量依賴性;C6可以抑制抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表達，上調(diào)凋亡蛋白Bax的表達，引起凋亡蛋白caspase-3前體procaspase-3下降。結(jié)論：毛蚶抗癌蛋白主要組分C6對人多種癌細胞活力具有抑制作用，可誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌Colo205細胞發(fā)生caspase通路依賴的細胞凋亡。

關(guān)鍵詞 毛蚶抗癌蛋白主要組分C6;層析分離;Colo205;HT-29;A549;K562;細胞凋亡;Caspase

Abstract Objective：In this study，the anticancer protein（ASAP） of the larvae was isolated and purified，and the anticancer effects of the main components of the anticancer protein of the larvae were studied.Methods：We separated ASAP by anion exchange chromatography，hydrophobic interaction chromatography，and gel filtration chromatography; combined p53 gene expression activation and CCK-8 cell viability assay to track the anticancer activity of the separated components; the CCK-8 cell viability assay detected the effects of the main components of the anti-cancer protein of ASAP on the viability of human colorectal cancer Colo205，HT-29，human lung cancer A549，and human chronic myelogenous leukemia K562; Annexin-V/PI double staining combined with flow cytometry was used to detect cell apoptosis.Results：C6，the main component of the anticancer active protein isolated from ASAP，can inhibit the cell viability of Colo205，HT-29，A549，and K562 to varying degrees within 24 to 72 hours.Among them，it has the most inhibitory effect on Colo205 cells.Obviously，the IC50 was 5.7 μg/mL at 72 h; C6 can induce Colo205 cell apoptosis in a dose-dependent manner; C6 can inhibit the expression of anti-apoptotic proteins Mcl-1 and Bcl-2，and up-regulate the apoptotic protein Bax expression and cause the decrease of the apoptotic protein caspase-3 precursor procaspase-3.Conclusion：C6，the main component of the anti-cancer protein of ASAP，has an inhibitory effect on the viability of a variety of human cancer cells，and can induce caspase pathway-dependent apoptosis in human colorectal cancer Colo205 cells.

Keywords Main component of ASAP C6; Chromatographic separation; Colo205; HT-29; A549; K562; Apoptosis; Caspase

中圖分類號：R73-36+2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.009

毛蚶（Arca subcrenata Lischke）為軟體動物門瓣鰓綱列齒目蚶科毛蚶屬海洋生物，其藥用歷史悠久，其殼為中藥瓦楞子（Arcae Concha）來源之一[1]，《醫(yī)林纂要·藥性》記載其能“攻堅破瘀。去一切痰積，血積，氣塊，破癥瘕，攻瘰疬”，據(jù)《食療本草》記載，其肉有“利五臟、溫中、消食”等功效。

本課題組前期進行了毛蚶水提物體外抗癌作用篩選和抗癌蛋白的分離、純化及抗癌機制研究，發(fā)現(xiàn)毛蚶水提物在體外對人紅白血病細胞K562、人乳腺癌細胞MCF-7以及人肺腺癌細胞A549具有顯著的抑制作用[2]，從毛蚶中獲得毛蚶抗癌蛋白（Arca subcrenata Antitumor Protein，ASAP）研究發(fā)現(xiàn)，ASAP可誘導(dǎo)細胞凋亡，激活p53表達[3-5]。p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)為常用的熒光素酶報告基因系統(tǒng)之一，利用該系統(tǒng)可方便地進行影響p53表達的內(nèi)外因素的研究[6-8]。本研究利用多種層析方法對ASAP進一步分離，聯(lián)合p53激活作用及體外細胞毒測定追蹤ASAP中可能的抗癌活性組分，并對其抗癌作用機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毛蚶

秋冬季節(jié)鮮毛蚶，產(chǎn)地中國大連，購自北京望京海鮮大市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學生命科學學院生物制藥系孫震曉教授鑒定為毛蚶（Arca subcrenata Lischke）。

1.1.2 細胞株

結(jié)合本課題組前期研究，實驗選用人結(jié)直腸癌細胞Colo205、HT29、人肺癌細胞A549、人慢性髓性白血病細胞K562，以上細胞系均保存于中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心免疫學實驗室。以上細胞系均使用RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國，貨號：SH30027.01）、胰酶（HyClone公司，美國，貨號：SV30037.01），胎牛血清（Gibco公司，美國，貨號：10099），DMSO（Sigma公司，美國，貨號：D2650）。CCK-8試劑盒（Dojindo同仁公司，日本，貨號：K1018），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號：KGA107），Pierce BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司，美國，貨號：23227）。兔抗人Caspase 3單克隆抗體、兔抗人Mcl-1單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab32151、ab32087、ab32124、ab32503），山羊抗兔IgG二抗、兔抗人GAPDH單克隆抗體（CST公司，美國，貨號：14708、5174）。

快速蛋白質(zhì)純化色譜系統(tǒng)（AKTA公司，瑞典，型號：Avant25），預(yù)裝柱（GE Healthcare公司，美國，型號：DEAE FF 5 mL、Phenyl FF 5 mL、SuperdexTM200 10/300 GL），高速控溫離心機（Hettich公司，德國，型號：UNIVERSAL 320），水平離心機及大容量離心機（Beckman Coulter公司，美國，型號：Allegra X-15R、Avanti J-26 XPI），全溫振蕩器（太倉豪誠實驗儀器制造有限公司，型號：THZ-D），酶標儀、化學發(fā)光儀（Biotek公司，美國，型號：Eon、Synergy2），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene公司，英國，型號：GeneGnome），超微量紫外分光光度計（Thermo公司，美國，型號：NanoDrop One），蛋白電泳儀（Bio-Rad公司，美國，型號：1658001），流式細胞儀（BD公司，美國，型號：Accuri C6）。

1.2 方法

1.2.1 毛蚶抗癌蛋白ASAP的分離純化

參考文獻[3-4]方法，通過低溫水提及硫酸銨沉淀等步驟制得ASA。層析純化方法參考文獻[9]，依次利用陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析對ASAP進行分離，使用ASAP濃度為6 mg/mL。DEAE陰離子交換層析使用A液（0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）+5 mmol/L NaCl，pH=8.0）上樣，10%、30%、100% B液（0.05 mol/L PBS+1 mol/L NaCl，pH=8.0）洗脫，分別收集洗脫峰，機器自動編號A1、A3、A5;Phenyl疏水層析作用使用C液（0.05 mol/L PBS+1 mol/L（NH4）2SO4，pH=8.0）上樣，0%、50%、100% A液洗脫，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分別收集洗脫峰，編號B1、B3、B5;使用Superdex200凝膠過濾層析法分離活性組分，50%C液+50%A液上樣，PBS（pH=7.4）洗脫，每1 mL為1個組分分別收集，編號為C1-C9。將得到的蛋白組分置于4 ℃透析、除鹽，然后超濾濃縮后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定各分離組分的p53激活活性

熒光素酶報告基因系統(tǒng)是將轉(zhuǎn)錄因子在DNA上的作用位點與報告基因連接，報告基因的表達程度與活化的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量呈線性關(guān)系，可直觀展示轉(zhuǎn)錄因子的活性狀態(tài)[11-13]，也可以高效靈敏地檢測基因的表達[14-15]。本實驗根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)毛蚶水提物可激活轉(zhuǎn)錄因子p53表達，使用本課題組前期構(gòu)建好的PP-P53-NLuc-A549細胞系通過檢測各組分對p53表達的影響篩選活性組分。

選取對數(shù)期A549細胞接種96孔板中，每孔加入1×104個細胞，設(shè)空白組、ASAP陽性對照組、蛋白組分低、中、高劑量處理組，每組3個復(fù)孔，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，空白組加入100 μL完全培養(yǎng)基，ASAP陽性對照組加入含100 μg/mL ASAP RPMI完全培養(yǎng)基100 μL，A1、A3、A5蛋白組分按10、20、40 μg/mL濃度，B1、B3、B5蛋白組分按1、2、4 μg/mL濃度，C1-C9蛋白組分按1、2、4‰（V/V）濃度，各組分均由RPMI1640完全培養(yǎng)基配制，每孔均加入100 μL，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h后棄舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，換上新鮮培養(yǎng)基，2 h后分別取上清液測其熒光值，每次取20 μL/孔，添加含有3 μmol/L腔腸素CTZ的PBST（1 L PBS+500 μL吐溫-20）100 μL，于化學發(fā)光儀中進行檢測，每個樣品檢測重復(fù)3次。

1.2.3 CCK8法檢測各分離組分細胞毒活性

參考文獻[16]，選用對數(shù)期K562細胞接種于96孔板中，按照細胞密度5×103個/mL每孔加入100 μL RPMI1640完全培養(yǎng)基，設(shè)對照組、ASAP陽性對照組、蛋白組分低、中、高劑量處理組，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后除去舊培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，對照組加入100 μL RPMI1640完全培養(yǎng)基，陽性對照加入ASAP濃度400 μg/mL，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分別選取蛋白組分A1、A3、A5濃度10、20、40 μg/mL，B1、B3、B5濃度1、2、4 μg/mL，C1-C9組分1、2、4‰（V/V），以上組分由RPMI1640完全培養(yǎng)基配制，每孔均加入100 μL，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL/孔含有10%（V/V）CCK-8試劑的培養(yǎng)基，測定吸光度并計算細胞活力。

細胞活力（%）=A（加藥）-A（空白）/A（0）-A（空白）×100%，其中A（加藥）指各觀察組細胞的吸光值，A（0）指空白組細胞的吸光值，A（空白）指不含細胞、只有CCK8培養(yǎng)基的背景吸光值。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染進行凋亡檢測

參考文獻[16]，Colo205細胞以5×105/孔接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入C6組分10、20、40 μg/mL，處理24 h。收集細胞，預(yù)冷PBS洗2次。加入500 μL結(jié)合緩沖液，5 μL PI染液，10 μL Annexin V染液，混勻，室溫避光15 min。300目尼龍網(wǎng)過濾，上流式檢測，使用軟件Image Lab分析結(jié)果。

1.2.5 Western Blotting法分析C6對Colo205細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

細胞處理方法同上，參照文獻[17]中描述的方法，離心收集細胞，加入細胞裂解液30 μL冰浴中裂解30 min。11 100×g，離心10 min，上清液移至新EP管，BCA法測定各樣品上清液蛋白濃度，樣品12%SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下封閉1.5 h，加入Caspase 3、Mcl-1、Bcl-2、Bax一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次膜，10 min/次。加入IgG抗兔二抗，在37 ℃溫育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL顯色。以GAPDH作為內(nèi)參分析目標蛋白的表達，并通過Image Lab分析每種蛋白在各組中的表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均數(shù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蚶抗癌蛋白ASAP進一步分離純化

毛蚶ASAP經(jīng)DEAE陰離子交換層析分離的FPLC圖，共3個洗脫峰，儀器自動編號依次命名為A1、A3、A5組分。見圖1。A1組分經(jīng)Phenyl疏水層析分離的FPLC圖，共有3個洗脫峰，儀器自動編號依次命名為B1、B3、B5組分。見圖2。B3組分經(jīng)Superdex200凝膠過濾層析分離的FPLC圖，每毫升為1個組分，共洗脫出9個組分，按洗脫順序分別命名為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9。見圖3。

2.2 p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)配合CCK-8法篩選活性組分

采用聯(lián)合p53激活及細胞活力抑制2個指標篩選各分離組分抗癌活性。

2.2.1 p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果

使用p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)對組分A1、A3、A5的活性進行驗證，與對照組比較，在不同濃度下，作用48 h后，只有A1組分對p53活性有較強的促進作用，且作用呈濃度依賴性;與陽性對照比較，A1組分在濃度為40 μg/mL作用48 h后達到了陽性對照類似的p53促進作用。見圖4A。使用p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)對組分B1、B3、B5的活性進行驗證，與對照組比較，在不同濃度下，作用48 h后，只有B3組分對p53活性有較強的促進作用，且作用呈濃度依賴性;與陽性對照比較，B3組分在濃度為4 μg/mL作用48 h后達到了陽性對照類似的p53促進作用。見圖4B。使用p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)對組分C1-C9的活性進行驗證，與對照組比較，作用48 h后，組分C6對p53表達的促進作用最為明顯;與陽性對照比較，C6組分在作用48 h后達到了陽性對照類似的p53促進作用。見圖4C。

2.2.2 CCK8法檢測結(jié)果

使用CCK-8方法對組分A1、A3、A5作用于K562的抑制率進行檢測，與對照組比較，在不同濃度作用24、48、72 h后，僅A1組分對K562有顯著抑制作用，故選取A1組分進行下一步分離。見圖5A。使用CCK-8方法對組分B1、B3、B5作用于K562的抑制率進行檢測，與對照組比較，在不同濃度下，作用24、48、72 h后，B1組分僅在2、4 μg/mL作用24 h時有抑制作用，只有B3組分在不同濃度及作用時間下均對K562有顯著抑制作用，因此選取B3組分進行下一步分離。見圖5B。使用CCK-8方法對組分C1-C9作用于K562的存活率進行檢測，與對照組比較，組分C5、C6在作用24、48、72 h后均對K562有較強的抑制作用，且作用均呈時間依賴性。結(jié)合p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定結(jié)果，我們選擇C6組分做進一步抗腫瘤機制研究。見圖5C。

2.3 C6對不同腫瘤細胞系的作用

使用C6對不同腫瘤細胞處理后，可見對K-562、A549、HT-29和Colo205細胞均有不同的抑制作用。其中對K-562和HT-29細胞在24 h時抑制率均較低，而在48 h和72 h時抑制率均較高且無明顯差異。且C6組分對K-562和HT-29細胞在不同濃度下的抑制作用無明顯差異。C6對A549細胞和Colo205細胞的抑制均呈濃度依賴性，其中對A549細胞的作用在低濃度時呈非時間依賴性。C6對Colo205細胞的抑制作用同時呈時間和濃度依賴性。見圖6。

2.4 C6誘導(dǎo)Colo205細胞凋亡情況

使用流式細胞術(shù)結(jié)合Annexin V-FITC/PI雙染法檢測不同濃度C6組分對Colo205細胞的凋亡作用，可以看出隨C6組分濃度的增高，Colo205總的凋亡率及早期凋亡率上升。見圖7，表1。

2.5 Western Blotting檢測Colo205細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達

Western Blotting檢測顯示C6組分10 μg/mL作用于Colo205細胞0、6、12、24、36、48 h凋亡相關(guān)蛋白表達結(jié)果，隨著藥物作用時間的延長，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達量顯著降低，凋亡蛋白Bax的表達量顯著升高，凋亡抑制蛋白Mcl-1在6～24 h表達量升高，36 h后表達量降低，48 h與未加藥組比較表達量顯著降低;凋亡蛋白caspase-3前體procaspase-3表達量下調(diào)，48 h時顯著降低。見圖8。

3 討論

本研究通過p53熒光素酶報告基因系統(tǒng)聯(lián)合細胞活力測定，對毛蚶抗癌蛋白ASAP經(jīng)陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析分離后得到的組分進行抗癌活性篩選，對有顯著體外細胞毒活性并明顯激活p53基因表達的毛蚶抗癌蛋白主要組分C6體外抗腫瘤活性進行了篩選，選擇了抑制作用具有時間和劑量依賴性的人結(jié)腸癌細胞Colo205進行了機制的研究。結(jié)果表明C6可以誘導(dǎo)Colo205細胞凋亡，與我們之前報道的毛蚶水提物和毛蚶抗癌蛋白ASAP的作用一致[2-5]。本研究檢測了常規(guī)與細胞凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax、Mcl-1、procaspase-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)C6可誘導(dǎo)Colo205細胞發(fā)生caspase-3依賴的細胞凋亡。

關(guān)于毛蚶提取物中抗癌多肽或蛋白的分離純化已有一些研究報道，如有研究發(fā)現(xiàn)毛蚶多肽組分P2可抑制7種癌細胞的增殖并促進胞內(nèi)ROS的高表達，激活細胞凋亡，抑制細胞周期蛋白B1/cdc2復(fù)合體的表達并促進P21表達，引起細胞周期阻滯[17-18];毛蚶多肽H3對人宮頸癌HeLa、人肝癌HepG2和人結(jié)直腸癌HT-29細胞均有顯著的增殖抑制作用[19];分離的小分子蛋白G-4-2對HeLa細胞、人早幼粒白血病HL-60的增殖有顯著抑制作用;小分子蛋白G-6對HL-60細胞的增殖有顯著抑制作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)毛蚶抗癌蛋白主要組分C6可顯著激活人腫瘤細胞P53蛋白活性，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌Colo205細胞caspase-3依賴的細胞凋亡，豐富了毛蚶抗癌活性成分的抗癌機制研究。

近年來，隨著海洋生物資源的大量開發(fā)利用，多種不同功能的海洋生物活性物質(zhì)被提取分離，不斷有新的海洋抗癌活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，其中海洋軟體動物中抗癌活性蛋白及多肽在其中占據(jù)了重要位置[21]。毛蚶蛋白或多肽是開發(fā)抗癌新藥的潛在資源，在目前毛蚶抗癌蛋白研究基礎(chǔ)上，結(jié)合其轉(zhuǎn)錄組、質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，借助虛擬篩選和蛋白原核或真核表達技術(shù)，可加快活性成分的發(fā)現(xiàn)和鑒定，為抗癌新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（2020-12-23收稿 責任編輯：楊覺雄）