何苗，李耀偉，王志琪，周志華，蒲科婷，叢夢靜，王嘉星

〔摘要〕 目的 從線粒體能量代謝角度研究甘草次酸對烏頭堿的心肌細胞毒性拮抗作用。方法 將大鼠心肌細胞H9c2細胞隨機分為10組，即空白組、甘草次酸組、4個烏頭堿組（烏頭堿120、240、480、960 μmol/L）、4個烏頭堿配伍甘草次酸組（不同濃度烏頭堿分別與60 μmol/L甘草次酸配伍）。采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法測定不同濃度給藥組對H9c2細胞的影響;采用ELISA法測定各組細胞三磷酸腺苷（adenosine 5-triphosphate， ATP）含量、ATP酶活性水平;采用活性氧探針（2，7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species， ROS）、線粒體膜電位探針（5，5′6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide， JC-1）檢測細胞內線粒體膜電位、鈣離子熒光探針（rhod-2 acetoxymethyl ester，Rhod-2AM）檢測細胞內鈣離子濃度。結果 與單用烏頭堿比較，烏頭堿配伍甘草次酸后心肌細胞的ATP含量、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性升高，ROS含量減少，線粒體膜電位、線粒體內鈣離子濃度降低（P<0.01或P<0.05）。結論 甘草次酸可拮抗烏頭堿的心肌細胞毒性，其機制可能是與保護心肌細胞線粒體、增強線粒體能量代謝、維持鈣穩(wěn)態(tài)有關。

〔關鍵詞〕 線粒體能量代謝;烏頭堿;甘草次酸;心肌毒性;鈣穩(wěn)態(tài)

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.002

Glycyrrhetinic Acid Against the Cardiotoxicity of Aconitine Based on Mitochondrial

Energy Metabolism

HE Miao1，2， LI Yaowei1， WANG Zhiqi2，3*， ZHOU Zhihua1， PU Keting3， CONG Mengjing3， WANG Jiaxing3

（1. Graduate School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Research Center of Standardization and Functional Engineering of Traditional Chinese Medicine in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the antagonistic effect of glycyrrhetinic acid on cardiomyocytes cytotoxicity of aconitine from the perspective of mitochondrial energy metabolism. Methods The H9c2 cells of rat cardiomyocytes were randomly divided into 10 groups： blank group， glycyrrhetinic acid group， 4 aconitine groups （aconitine 120， 240， 480， 960 μmol/L）， and 4 aconitine combined with glycyrrhetinic acid groups （aconitine in different concentrations was compatible with 60 μmol/L glycyrrhetinic acid）. The effect of different concentrations on the H9c2 cell was determine by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）. The content of adenosine5-triphosphate （ATP） and the level of ATP enzyme activity in each group were measured by ELISA. The intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by 2，7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate （DCFH-DA）， 5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide （JC-1） was used to detect intracellular mitochondrial membrane potential and rhod-2 acetoxymethyl ester （Rhod-2AM） probe was used to detect intracellular calcium ion concentration. Results Compared with aconitine alone， the ATP content， Ca2+-ATPase， Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase activities of cardiomyocytes were significantly increased after aconitine combined with glycyrrhetinic acid. The ROS content， mitochondrial membrane potential and intracellular calcium concentration were significantly decreased （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Glycyrrhetinic acid can reduce the cardiotoxicity of aconitine， which may be related to the protection of mitochondria of cardiomyocytes， the enhancement of mitochondrial energy metabolism and the maintenance of calcium homeostasis.

〔Keywords〕 mitochondrial energy metabolism; aconitine; glycyrrhetinic acid; cardiotoxicity; calcium homeostasis

附子為典型的毒效共存中藥，配伍是降低其毒性常用的方法之一[1-2]。在“中藥方劑數據庫”網站檢索發(fā)現：約有96%含烏頭類藥材（附子或川烏、草烏）方劑中同時含甘草[3]。課題組前期研究[4-6]表明，附子單煎液對離體心衰蛙心及大鼠心臟都有強心作用;與甘草配伍后，其強心作用較附子單煎液弱;烏頭堿和甘草次酸Tmax均推遲，Cmax均降低，吸收均受到抑制，t1/2均縮短[7]。

一般認為，附子的主要毒性成分是烏頭類生物堿，其中毒性較強是烏頭堿，主要影響心血管、神經等系統(tǒng)[8]，心臟是其毒性作用的主要靶器官[9]，大劑量時會誘發(fā)心律失常。研究還發(fā)現，烏頭堿的心肌毒性可表現為影響心肌細胞能量代謝，配伍甘草次酸后可有效拮抗烏頭堿引發(fā)的心律失常[10]。線粒體是心肌細胞中主要負責能量代謝的細胞器，膜電位、三磷酸腺苷（adenosine 5-triphosphate， ATP）、Ca2+濃度等是表征相關功能的經典指標[11]，且其正常的能量代謝功能與細胞內鈣穩(wěn)態(tài)密切相關[12]。當心臟組織受到損傷時，心肌細胞內活性氧（reactive oxygen species， ROS）釋放增多、Ca2+濃度失衡、能量代謝紊亂[13]。

故本研究以心肌細胞線粒體能量代謝為切入點，以ATP含量、線粒體膜電位、ROS濃度、線粒體Ca2+濃度、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性為指標，在細胞水平對甘草次酸拮抗烏頭堿心肌毒性作用進行研究。

1 材料

1.1? 實驗細胞系

大鼠心肌細胞（H9c2）購自普諾賽生物公司，貨號：CL-0089。將H9c2細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃條件下進行培養(yǎng)，待細胞密度達90%左右后0.25%胰酶消化傳代，平均2～3 d一代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2? 實驗藥物

烏頭堿（aconitine， AC）儲備液：將20 mg烏頭堿溶于150 μL DMSO中，而后將含烏頭堿的DMSO溶解于31 mL空白DMEM培養(yǎng)基中，渦旋混勻，使之成為1 mmol/L的烏頭堿儲備液，以0.22 μm針頭式一次性過濾器除菌后分裝于15 mL的離心管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

甘草次酸（alycyrrhizic acid， GA）儲備液：將20 mg甘草次酸溶于200 μL DMSO中，而后將含甘草次酸的DMSO溶解于21 mL空白DMEM培養(yǎng)基中，渦旋混勻，使之成為2 mmol/L的甘草次酸儲備液，以0.22 μm針頭式一次性過濾器除菌后分裝于15 mL的離心管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）儲備液：將250 mg MTT溶解于50 mL PBS中，渦旋混勻，使之成為5 mg/mL的MTT儲備液，以0.22 μm針頭式一次性過濾器除菌后分裝于15 mL的離心管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 主要試劑與儀器

特級胎牛血清（批號：124210-500）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：PM150210）、PBS緩沖液（批號：PB180327）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號：PB180226）、無血清非程序凍存液（批號：PB180438 ）、D-Hanks液（批號：PB180321）均購于普諾賽生命科技有限公司;噻唑藍（MTT）（批號：M8180）、二甲基亞砜（DMSO）（培養(yǎng)級，批號：D8371）、線粒體膜電位試劑盒（批號：M8650）、青鏈霉素混合液（批號：P1400）均購于索萊寶生物科技有限公司;Hanks平衡鹽溶液（HBSS）（批號：M120702）購于上海源培生物科技股份有限公司;二甲基亞砜（DMSO）（分析級，批號：D806645）、烏頭堿對照品（批號：DST200729-006，純度≥98%）、甘草次酸對照品（批號：DST200619-007，純度≥98%）均購于德斯特生物技術有限公司;ATP含量測定試劑盒（批號：A095-2-1）、Ca2+-ATP酶試劑盒（批號：A070-4-1）、Na+-K+-ATP酶試劑盒（批號：A070-2-2）、Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒（批號：A070-3-2）、ROS測定試劑盒（批號：E004-1-1）均購于南京建成生物科技研究所;Rhod-2 AM鈣熒光探針（批號：21060）購于美國AAT BIOQUES公司。

HERACELL 150i三氣培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）;SW-CJ潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;BX51倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;IX51熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;TS2熒光倒置顯微鏡（尼康光學儀器中國有限公司）;HH.S21-8恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;5180R高速離心機（德國EPPENDORF公司）;TG16W醫(yī)用離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）;XW-18D旋渦混合器（紹興市蘇珀儀器有限公司）;F570-86 -80 ℃超低溫冰箱（德國EPPENDORF公司）;BCD-258WDPM醫(yī)用冷藏冷凍箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）;1510多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）;SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋（重慶雅馬拓科技有限公司）;BGZ-240電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;TY-80B水平搖床（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）。

2 方法

2.1? 實驗分組

2.1.1? 甘草次酸給藥濃度的確定? 本部分按照文獻[14]將實驗用細胞分為共7組，分別為空白組（接種細胞，給與培養(yǎng)基、MTT、DMSO），甘草次酸20 μmol/L組、30 μmol/L組、60 μmol/L組、90 μmol/L組、120 μmol/L組、調零孔組（不接種細胞，給與培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。

2.1.2? 烏頭堿配伍甘草次酸前后心肌細胞存活率實驗? 本部分實驗用細胞共分為11組，分別為空白組（接種細胞，給與培養(yǎng)基、MTT、DMSO）;烏頭堿單用組參考文獻[15]及預實驗將按等比共設為4組，即120、240、480、960 μmol/L烏頭組，分別簡稱烏頭堿單用一組、烏頭堿單用二組、烏頭堿單用三組、烏頭堿單用四組;60 μmol/L甘草次酸組;烏頭堿配伍60 μmol/L甘草次酸組共4組，即120 μmol/L烏頭堿配伍60 μmol/L甘草次酸組、240μmol/L烏頭堿配伍60 μmol/L甘草次酸組、480 μmol/L烏頭堿配伍60 μmol/L甘草次酸組、960 μmol/L烏頭堿配伍60 μmol/L甘草次酸組，分別簡稱配伍甘草次酸一組、配伍甘草次酸二組、配伍甘草次酸三組、配伍甘草次酸四組;調零孔組（不接種細胞，給與培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。

2.1.3? 心肌細胞能量代謝相關指標檢測實驗? 本實驗用細胞共分為10組，不設調零孔組，其余各組參見“2.1.2”項下。

2.2? 細胞存活率計算

細胞存活率參照文獻[16]中公式計算：細胞活力=[A給藥組-A調零孔組]/[A空白組-A調零孔組]×100%，其中A給藥組：經給藥處理并以MTT、DMSO處理后的孔的吸光度，A調零孔組：無細胞，其余步驟相同處理的孔的吸光度，A空白組：未經給藥并以MTT、DMSO處理后的孔的吸光度。

2.3? MTT法測定甘草次酸的給藥濃度

取對數生長期的H9c2細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24 h后更換無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后棄去DMEM，按照“2.1.1”分組，分組后給予對應藥物，空白組、調零孔組給予空白DMEM，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸出藥液，各孔加入100 μL 0.5 μmol/L的MTT，培養(yǎng)箱內孵育4 h，棄去MTT，加入100 μL DMSO，置于搖床低速震蕩10～15 min后使用酶標儀在490 nm處測定吸光度。

2.4? MTT法測定烏頭堿配伍甘草次酸前后心肌細胞存活率

取對數生長期的H9c2細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24 h后更換無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去DMEM，按照“2.1.2”分組，分組后給予對應藥物，空白組、調零孔組給予空白DMEM，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其余步驟參照“2.3”項。

2.5? 心肌細胞能量代謝指標檢測

2.5.1? ELISA法檢測心肌細胞內ATP含量? 取對數生長期的H9c2細胞以1×105個/mL的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換空白DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，吸去培養(yǎng)基，按照“2.1.3”分組，分組后給予對應藥物，其中空白組給予空白DMEM，培養(yǎng)24 h，吸去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1次，然后每孔加入300 μL裂解液，裂解細胞。按照ATP含量試劑盒操作步驟，用多功能酶標儀測定RLU值（相對光單位），根據標準曲線計算樣本中ATP濃度。

2.5.2? DCFH-DA染色法測定心肌細胞內ROS濃度? 按照“2.5.1”中的相關步驟培養(yǎng)H9c2細胞，藥物處理后，按照ROS測定試劑盒的使用說明書進行后續(xù)操作，最后按照異硫氰酸熒光素熒光檢測條件，使用熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。檢測完成后使用Image J軟件對其進行分析。

2.5.3? 線粒體膜電位探針（5，5′6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide， JC-1）染色法測定心肌細胞線粒體膜電位。按照“2.5.1”項中的相關步驟培養(yǎng)H9c2細胞，藥物處理后，采用JC-1染色法檢測線粒體膜電位，具體步驟按試劑盒說明書進行操作，使用熒光顯微鏡觀察、拍照。檢測完成后使用Image J軟件對其進行分析。

2.5.4? Rhod-2 AM探針法檢測心肌細胞線粒體Ca2+濃度? 按照“2.5.1”項下步驟培養(yǎng)細胞，藥物處理后，按照以下步驟操作：按1∶1 000用無酚紅無血清培養(yǎng)基稀釋Rhod-2AM熒光探針，使其終濃度為5 μmol/L，去除含藥培養(yǎng)基，以HBSS清洗細胞1次，每孔加入1 mL 5 μmol/L的 Rhod-2 AM熒光探針，放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min后，用HBSS平衡鹽溶液洗滌細胞2次，加入少量空白無酚紅培養(yǎng)基，熒光倒置顯微鏡下按照四甲基羅丹明-5（6）-異硫氰酸熒光條件觀察、拍照。檢測完成后使用Image J軟件對其進行分析。

2.5.5? ELISA法檢測Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性? 按照“2.5.1”項步驟培養(yǎng)細胞，藥物處理后，首先去除含藥培養(yǎng)基，以PBS清洗細胞2次后，每孔加入0.5 mL 0.25%胰酶消化50 s，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化。收集細胞至2 mL離心管，350 g離心5 min，棄去上清后加入300 μL 生理鹽水，渦旋混勻，制備成106～107/cm3的細胞懸液，使用反復凍融法破碎細胞。反復凍融法步驟如下：將細胞懸液在-20 ℃冰箱內冷凍30 min以上，然后在37 ℃水浴中解凍，重復3次裂解細胞。再嚴格按照BCA試劑盒說明書測定各樣本總蛋白濃度。最后嚴格按照Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶試劑盒說明書測定各樣本ATP酶活性。

2.6? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行處理，先對數據進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，若服從正態(tài)分布且滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數據之間采用LSD多重比較，若服從正態(tài)分布而不滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數據之間采用Games-Howell多重比較，若不服從正態(tài)分布，則進行非參數檢驗，計量數據以“x±s”表示。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 甘草次酸給藥濃度確定

甘草次酸選擇心肌細胞存活率與空白組無顯著差異的最高安全濃度，以期各組分在安全濃度范圍下最大可能地發(fā)揮其減毒作用，因此，確定甘草次酸的給藥濃度為60 μmol/L。見圖1。

3.2? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞存活率提高

與空白組比較，烏頭堿會降低心肌細胞存活率（P<0.01），且該作用與劑量呈正比關系;與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，心肌細胞存活率均提高（P<0.01）。見表1。

3.3? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞內ATP含量增加

與空白組比較，烏頭堿降低心肌細胞ATP含量（P<0.01），且該作用與劑量呈正比關系;與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，心肌細胞內ATP含量均升高（P<0.01）。見表2。

3.4? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞內ROS含量降低

與空白組比較，烏頭堿提高心肌細胞內ROS含量（P<0.01），且該作用與劑量呈現正比關系;與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，心肌細胞內ROS含量均降低（P<0.01）。見表2、圖2。

3.5? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞線粒體膜電位提高

與空白組比較，烏頭堿降低心肌細胞線粒體膜電位（P<0.01或P<0.05），且該作用與劑量呈現正比關系;與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，心肌細胞線粒體膜電位提高（P<0.01或P<0.05）。見表2、圖3。

3.6? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞線粒體內 Ca2+濃度降低

與空白組比較，烏頭堿使心肌細胞線粒體內鈣離子濃度增加（P<0.01），該作用與劑量呈現正比關系;與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，可降低心肌細胞內線粒體內鈣離子濃度（P<0.01）。見圖4、表3。

3.7? 烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞內Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性提高

與空白組比較，烏頭堿降低心肌細胞內Ca2+-ATP酶活性（P<0.01）、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（P<0.01或P<0.05）、Na+-K+-ATP酶活性（P<0.01），該作用與劑量呈現正比關系。與單用烏頭堿組相比，烏頭堿與甘草次酸配伍后，可提高心肌細胞內Ca2+-ATP酶活性（P<0.01或P<0.05）、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（P<0.01或P<0.05）、Na+-K+-ATP 酶活性（P<0.01或P<0.05）。見表3。

4 討論

“附子-甘草”是相畏相殺的經典藥對，也是中藥配伍減毒研究的熱點。組分配伍研究是一種闡明中藥配伍關系的新模式，遵循“復雜-簡單-復雜”研究原則，具有作用靶點明確、作用機制清楚等優(yōu)點[17]。故本文將烏頭堿與甘草次酸組分配伍作為研究對象，以探討“附子-甘草”藥對配伍減毒機制。H9c2細胞在心肌細胞信號傳導通路、細胞周期凋亡調控相關基因表達和細胞增殖及心肌細胞損傷保護機制方面的研究中應用廣泛[18-21]。本研究結果顯示，單用烏頭堿降低心肌細胞存活率，烏頭堿與甘草次酸配伍后心肌細胞存活率顯著提高，證實甘草次酸可拮抗烏頭堿所致的心肌細胞毒性作用。

本研究發(fā)現，單用烏頭堿時，心肌細胞ATP含量、膜電位水平降低，ROS含量則明顯上升;烏頭堿與甘草次酸配伍后，心肌細胞ATP含量、膜電位水平明顯上升，ROS含量則明顯降低。烏頭堿的心肌毒性主要是損傷心肌細胞線粒體[22]，線粒體的損傷途徑主要包括：（1）破壞線粒體內膜完整性，使線粒體ATP減少;（2）產生大量ROS，對線粒體造成氧化損傷;（3）誘導線粒體通透性轉換孔過度開放，引起線粒體膜電位下降[23]。ATP含量可以直觀反映心肌細胞內能量代謝的水平，而線粒體是心肌細胞中負責能量代謝的重要細胞器，線粒體正常膜電位是維持線粒體能量代謝的先決條件。一方面，線粒體在呼吸氧化過程中，將所產生的能量以電化學勢能儲存于線粒體內膜，在內膜兩側造成質子以及其他離子濃度的不對稱分布而形成膜電位。另一方面，線粒體在產能的同時會產生大量的ROS，而當ROS過高時，線粒體通透性轉換孔的開放又會導致線粒體通透性的增加。故，此部分研究結果提示，甘草次酸緩解烏頭堿對心肌細胞的損傷與其改善心肌細胞線粒體功能有關。

線粒體還是維持心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的重要緩沖器，而心肌細胞內Ca2+的轉運異常則會引起心臟結構變化和功能的紊亂[24]，最終容易誘發(fā)心律失常、心力衰竭等癥。正常情況下，心肌細胞內相關ATP酶對維持心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)以及線粒體鈣穩(wěn)態(tài)都具有重要作用，此類酶的活性也能反映細胞內能量代謝的水平。其中，Ca2+-ATP酶主要是將細胞內游離Ca2+轉出細胞或攝入肌漿網，以預防細胞內鈣超載[25];Ca2+-Mg2+-ATP酶促進肌漿網內Ca2+的釋放，并轉運至胞外，維持胞內鈣穩(wěn)態(tài)[26];Na+-K+-ATP酶通過泵出細胞內的Na+和泵入胞外的K+以維持細胞內外離子濃度穩(wěn)定和動態(tài)平衡，從而維持心肌細胞的正常節(jié)律; Na+/Ca2+交換間接可調控細胞內的Ca2+活動，對維持線粒體膜內外離子平衡、滲透壓平衡發(fā)揮重要作用[27]。本實驗研究發(fā)現，單用烏頭堿時，心肌細胞線粒體內Ca2+濃度提高，心肌細胞內Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶的活性出現顯著降低，表明烏頭堿有心肌毒性;與甘草次酸配伍后，線粒體內Ca2+濃度降低，3種ATP酶活性提高。由此可見，甘草次酸拮抗烏頭堿的心肌毒性與增加ATP酶活性，從而促進細胞內Ca2+轉入肌漿網或細胞外，進而緩解線粒體鈣超載，維持鈣穩(wěn)態(tài)有關。

綜上所述，本實驗研究結果證實，甘草次酸可拮抗烏頭堿的心肌毒性，改善心肌細胞線粒體能量代謝，其解毒作用環(huán)節(jié)涉及增加ATP生成、抑制ROS釋放、平衡膜電位等，具體機制可能與緩解線粒體鈣超載有關。

參考文獻

[1] 彭? 偉，王? 琳，傅超美，等.基于網絡藥理學的附子抗心力衰竭作用和心臟毒性的毒效二重性研究[J].中醫(yī)雜志，2021，62（6）：523-529.

[2] 宋亞剛，崔琳琳，李? 艷，等.中藥“減毒藥對”研究方法探討及思考[J].中華中醫(yī)藥學刊，2020，38（10）：76-80.

[3] 劉曾晶，張夢林，康前前，等.基于數據挖掘的抗腫瘤中藥方劑用藥規(guī)律分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2020，16（8）：143-146.

[4] 彭? 蘭.附子配甘草對離體心臟的作用及其指紋圖譜研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2019.

[5] 張序晴，彭? 蘭，李? 賽，等.附子-甘草對離體蛙心的影響及其指紋圖譜研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2019，39（2）：184-189.

[6] 彭? 蘭，張序晴，王志琪，等.附子-甘草對離體大鼠衰竭心臟的影響及其指紋圖譜研究[J].中南藥學，2019，17（3）：379-383.

[7] 王志琪，曾? 嶸，譚志榮，等.附子與甘草配伍前后烏頭堿和甘草次酸在大鼠體內的藥動學比較[J].中成藥，2012，34（12）：2305-2309.

[8] 彭? 成.中藥附子毒效多維評價與整合分析的思路與實踐[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（11）：2543-2550.

[9] 謝曉芳，彭? 成.附子心臟毒效的多維評價和整合分析研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（11）：2555-2562.

[10] 楊繼媛，吳紅金.甘草次酸抗實驗性心律失常及機制的研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2010，8（10）：1229-1231.

[11] 高? 艷，謝靈燕，盧志強.附子毒理及減毒增效配伍的研究進展[J].天津藥學，2020，32（1）：65-69.

[12] 趙佳偉，何家樂，馬增春，等.附子對H9c2心肌細胞系線粒體的毒性作用機制[J].中國藥理學與毒理學雜志，2015，29（5）：816-824.

[13] 肖? 晨，陳思君，危當恒，等.線粒體功能的檢測方法[J].生命的化學，2020，40（2）：222-229.

[14] 王利勤，張宇燕，何? 昱，等.附子、甘草有效成分不同配伍比例對H9c2心肌細胞缺氧缺糖損傷的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57（15）：1327-1331.

[15] 周天梅.附子甘草活性物質配伍對烏頭堿致傳代心肌細胞損傷保護作用的實驗研究[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學，2013.

[16] 劉長河，李開言，張雪俠，等.木豆葉、鮮地黃提取物對ox-LDL損傷的HUVEC的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2021，32（8）：1073-1078.

[17] 李? 文，傅超美，傅? 舒.附子配伍甘草對大鼠心肌細胞毒性機制的研究進展[J].中藥與臨床，2018，9（6）：60-64.

[18] 覃斐章，董? 敏，秦秋華，等.玉郎傘查爾酮激活Nrf2/ARE信號通路減輕缺氧/復氧所致的H9c2細胞凋亡及氧化應激損傷[J].天然產物研究與開發(fā)，2020，32（6）：1038-1044.

[19] 李? 津，李? 羽，劉明潔.藍萼甲素對H2O2誘導H9c2心肌細胞凋亡的保護作用及機制研究[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2020，42（12）：1137-1144.

[20] 楊? 萍，代? 天，張?zhí)K川.當歸多糖促進大鼠心肌細胞系H9c2增殖[J].基礎醫(yī)學與臨床，2021，41（4）：551-557.

[21] 楊? 潔，鄭瑞芳，都研文，等.田薊苷抗H9c2心肌細胞缺血再灌注損傷的作用機制研究[J].藥學學報，2021，56（4）：1070-1078.

[22] 王寧寧.烏頭堿激活Sirt3改善心肌細胞線粒體功能[D].廣州：廣東藥科大學，2019.

[23] 雷? 蕾，彭雙清.藥物損傷心肌細胞線粒體致心臟毒性的分析[J].河南大學學報（醫(yī)學版），2012，31（2）：138-141.

[24] TAKAHASHI M， YOKOSHIKI H， MITSUYAMA H， et al. SK channel blockade prevents hypoxia-induced ventricular arrhythmias through inhibition of Ca2+/voltage uncoupling in hypertrophiedhearts[J]. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology， 2021， 320（4）： H1456-H1469.

[25] SKOGESTAD J， ARONSEN J M， TOVSRUD N， et al. Coupling of the Na+/K+-ATPase to Ankyrin B controls Na+/Ca2+ exchanger activity in cardiomyocytes[J]. Cardiovascular Research， 2020， 116（1）： 78-90.

[26] DESHPANDE L S， DELORENZO R J， CHURN S B， et al. Neuronal-specific inhibition of endoplasmic Reticulum Mg2+/Ca2+ ATPase Ca2+ uptake in a mixed primary hippocampal culture model of status epilepticus[J]. Brain Sciences， 2020， 10（7）： 438.

[27] SILVA C I D， GON？覶ALVES-DE-ALBUQUERQUE C F， DE MORAES B P T， et al. Na/K-ATPase： Their role in cell adhesion and migration in cancer[J]. Biochimie， 2021， 185： 1-8.

（本文編輯? 蘇? 維）