張逢，戴宗順，林也，蔡雄，宋厚盼，陳聰，廖菁

〔摘要〕 目的 探討Th17/Treg細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（痹證）中的表達(dá)情況及“風(fēng)寒濕”外邪影響痹證發(fā)生的分子機(jī)制。方法 （1）雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）組和AIA風(fēng)寒濕痹組，每組30只。正常對(duì)照組和單純AIA組大鼠正常飼養(yǎng);AIA風(fēng)寒濕痹組每天置于人工智能氣候箱內(nèi)接受風(fēng)寒濕刺激，14 d后單純AIA組和AIA風(fēng)寒濕痹組免疫含有熱滅活結(jié)合桿菌的完全弗氏佐劑（CFA）;AIA風(fēng)寒濕痹組CFA免疫后風(fēng)寒濕再刺激6 d。各組動(dòng)物CFA免疫前1天、免疫后第6、10天，分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，分析Th17/Treg細(xì)胞比例。（2）雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AIA風(fēng)寒濕痹組，每組10只。正常對(duì)照組和AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠的實(shí)驗(yàn)條件同（1）。CFA免疫后第14天麻醉大鼠，分離PBMCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞pSTAT3蛋白、CD4+IL-17+淋巴細(xì)胞pSTAT4和pSTAT6的蛋白平均熒光強(qiáng)度，RT-PCR檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞中RORγt、Foxp3、STAT3、STAT4、STAT6 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 隨著AIA風(fēng)寒濕痹大鼠病情的進(jìn)展，外周血CD4+Th17細(xì)胞比例逐漸增加，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例逐漸降低，與同時(shí)間點(diǎn)單純AIA組大鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與正常對(duì)照組比較，AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠外周血CD4+pSTAT3+和CD4+IL-17+pSTAT4+及CD4+IL-17+pSTAT6+蛋白表達(dá)量顯著增加，CD4+T細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)量顯著降低，而RORγt、STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 “風(fēng)寒濕”外邪可能通過JAK/STAT信號(hào)通路激活Th17細(xì)胞分化，并抑制Treg細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡，從而促進(jìn)RA病證的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;痹證;“風(fēng)寒濕”外邪;Th17/Treg;JAK/STAT信號(hào)通路

〔中圖分類號(hào)〕R255.6? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.003

Mechanistic Studies of Th17/Treg Imbalance Influenced by Exogenous Wind-cold-damp

Pathogens on the Development of Rheumatoid Arthritis

ZHANG Feng1， DAI Zongshun2， LIN Ye1， CAI Xiong1， SONG Houpan2， CHEN Cong2， LIAO Jing1，2*

（1. Hunan Key Laboratory of Chinese Medicine Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry Training Bases， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Translational Research in TCM Formulas and Zheng， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the molecular mechanism of “wind-cold-damp” （FHS） exogenous pathogenic factors and the expression of Th37/Treg cells on Bi syndrom （rheumatoid arthritis， RA）. Methods （1） Ninety male SD rats were randomly and evenly assigned into normal control group， simple adjuvant-induced arthrtis （AIA） group and FHS+AIA group. Normal control group and simple AIA group were normally fed， and the FHS+AIA group was placed in an intelligent artificial climate box every day to receive FHS stimulation. After 14 days of FHS stimulation， rats in the simple AIA group and FHS+AIA group were injected complete Freuds adjuvant （CFA） containing heat-inactivated Mycobacterium tuberculosi to establish AIA. FHS+AIA group continued to receive FHS stimulation for additional 6 days. Peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） were isolated 1 day before， 6 and 10 days after CFA immunization. Percentages of CD4+Th17 and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells were detected by flow cytometry. （2） Twenty male SD rats were randomly and evenly assigned into normal control group and FHS+AIA group. The experimental conditions of rats in normal control group and FHS+AIA group were the same （1）. On day 14 after CFA injection， rats were anesthetized and blood specimens were collected for isolation of PBMCs. Mean fluorescence intensity of pSTAT3 protein in CD4+T cells， pSTAT4 and pSTAT6 proteins in CD4+IL-17+T cells were detected and analyzed by flow cytometry， and mRNA expression levels of RORγt， Foxp3， STAT3， STAT4， and STAT6 in CD4+T cells were examined by RT-PCR. Results With the progression of the disease in FHS+AIA group of rats， the proportion of peripheral blood CD4+Th17 cells gradually increased， and the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells gradually

decreased， compared with the simple AIA group of rats at the same time point， the difference was statistically significant （P<0.05 or P<0.01）. Compared with normal control group of rats， FHS+AIA group of rats showed significantly elevated fluorescent intensities of CD4+pSTAT3+， CD4+IL-17+pSTAT4+ and CD4+IL-17+pSTAT6+ proteins in the peripheral blood， markedly decreased mRNA level of Foxp3 and significantly increased mRNA levels of RORγt， STAT3， STAT4， and STAT6 detected in CD4+T cells， the difference was statistically significant （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion FHS exogenous pathogenic factors may activate the differentiation of CD4+Th17 cells and inhibit the differentiation of Treg cells through the JAK/STAT signaling pathway， leading to imbalance of Th17/Treg cells， thus promoting the occurrence of RA syndrome.

〔Keywords〕 rheumatoid arthritis; Bi syndrom; wind-cold-damp exogenous pathogenic factors; Th17/Treg; JAK/STAT signaling pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、軟骨及骨組織侵蝕，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形為主要臨床特征的慢性、系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]。流行病學(xué)研究[2-3]表明，全球RA發(fā)病率約為0.5%～1.2%，我國(guó)RA患病率約為0.28%～0.36%，其5年致殘率高達(dá)30%～50%，至今仍缺乏理想的治療藥物與方法，是造成勞動(dòng)力喪失及致殘的主要疾病之一。RA病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與遺傳、飲食和環(huán)境等因素有關(guān)[4]。根據(jù)其臨床癥狀和體征，RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，與中醫(yī)古籍所記載的“歷節(jié)”“鶴膝風(fēng)”“尪痹”等病證相似[5]。對(duì)其病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，《素問·痹論》有云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹、寒氣勝者為痛痹、濕氣勝者為著痹也”“不與風(fēng)寒濕氣合，故不為痹”[6-7]。另外，痹的產(chǎn)生與飲食和生活環(huán)境有關(guān)，所謂“食飲居處，為其病本也”[6]。

基于“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也”的中醫(yī)經(jīng)典理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于環(huán)境因素在RA發(fā)病機(jī)制中重要作用的認(rèn)識(shí)，推測(cè)“風(fēng)寒濕”外邪能顯著影響RA的發(fā)生和/或發(fā)展。選擇應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthrtis， AIA）動(dòng)物模型，采用改良人工智能氣候箱，給予大鼠風(fēng)寒濕刺激，再誘導(dǎo)AIA的方案，研究“風(fēng)寒濕”外邪刺激對(duì)AIA發(fā)生發(fā)展的影響[8]。李鑫等[9]研究表明，“風(fēng)寒濕”外邪只影響AIA的發(fā)生，其在疾病初發(fā)階段中醫(yī)證候表現(xiàn)為風(fēng)寒濕痹證。

RA的特征是以大量CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性滑膜炎癥反應(yīng)，而大鼠AIA也是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性炎癥動(dòng)物模型[10]。CD4+T細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞的重要成分，可參與免疫應(yīng)答過程中的各個(gè)階段，其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常被認(rèn)為是RA的主要發(fā)病機(jī)制之一[9-10]。用流式細(xì)胞儀初步檢測(cè)了風(fēng)寒濕刺激14 d后大鼠外周血T細(xì)胞種類和表面抗原，顯示CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)量明顯升高[9]。根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子及其與之相關(guān)的功能不同，通常將CD4+T細(xì)胞分為Th1、Th2、Th17和Treg四大亞群。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常飼養(yǎng)大鼠比較，風(fēng)寒濕刺激大鼠可見CD4+Th17細(xì)胞亞群明顯增多，血清IL-17含量顯著升高[11]。因此，本研究主要圍繞CD4+Th17分化和Th17/Treg失衡，進(jìn)一步深入探討“風(fēng)寒濕”外邪影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（痹證）發(fā)生的分子機(jī)制，以期為中醫(yī)論治痹證與相關(guān)藥物研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量為90～110 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXX（湘）2011-0003，合格證編號(hào)：43004700008303;43004700008412;43004700008456;43004700008423。飼養(yǎng)處及實(shí)驗(yàn)地：湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009，室溫（22±3） ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由采食，分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物房中明暗交替（12 h白天∶12 h黑夜），動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境7 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2? 主要試劑

熱滅活結(jié)合桿菌H37Ra（批號(hào)：20170320）、礦物油（批號(hào)：M8410）、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（批號(hào)：F4375）均購自美國(guó)Sigma Aldrich公司;抗鼠CD4抗體（批號(hào)：11-0040-81）、抗鼠IL-17抗體（批號(hào)：12-7177-81）、抗鼠CD25抗體（批號(hào)：12-0251-81）、抗鼠pSTAT3抗體（批號(hào)：MA5-32089）、抗鼠pSTAT4抗體（批號(hào)：71-7900）、抗鼠pSTAT6抗體（批號(hào)：PA5-104892）、抗鼠Foxp3-APC抗體（批號(hào)：17-5773-80）、試劑A破膜劑（批號(hào)：23228）、試劑B破膜劑（批號(hào)：23224）均購自美國(guó)eBioscience公司;異氟烷氣體麻醉劑（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)：084989）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)ABI公司，批號(hào)：4374967）;SYBR Premix Ex TaqTM II RORγt試劑盒（上海生物工程技術(shù)公司，批號(hào)：B110032）。

1.3? 主要儀器

改良人工智能氣候箱（上海汗諾儀器公司，型號(hào)：PRX-150）;250i細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)：51033587）、超微量核酸定量檢測(cè)儀（型號(hào)：701-058112）均購自美國(guó)Thermo Fisher公司;全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：TC20）;熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司;型號(hào)：AXYPCR384LC480CNF）;氣體麻醉機(jī)（美國(guó)SurgriVet公司，型號(hào)：SurgiVet CDS9000）;流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)Becton Dickinson公司，型號(hào)：TM X-20）;臺(tái)式超高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：Allegra 64R）;電子天平（日本島津公司，型號(hào)：ATY224）。

2 方法

2.1? AIA風(fēng)寒濕痹大鼠體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞失衡檢測(cè)

2.1.1? 分組與造模? 動(dòng)物模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)[8-9]，90只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純AIA組和AIA風(fēng)寒濕痹組，每組30只。正常對(duì)照組和單純AIA組大鼠正常飼養(yǎng)14 d;AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠每天置于人工智能氣候箱內(nèi)接受風(fēng)寒濕刺激（風(fēng)速5 m/s、溫度0～2 ℃、相對(duì)濕度90%～95%）1次，每次4 h，14 d后，除正常對(duì)照組外，其他兩組于尾根部皮下注射0.1 mL含200 g Mtb的CFA誘導(dǎo)AIA，AIA風(fēng)寒濕痹組CFA免疫后繼續(xù)接受風(fēng)寒濕刺激6 d。

2.1.2? AIA關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定? CFA免疫后，依據(jù)大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的特性，采用5級(jí)評(píng)分法[12]對(duì)CFA免疫后的大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分：正常情況，無紅腫，計(jì)0分;腳趾關(guān)節(jié)紅斑或輕度紅腫，計(jì)1分;趾關(guān)節(jié)和足跖或踝關(guān)節(jié)中度紅腫，記2分;踝關(guān)節(jié)以下足爪全部紅腫或者踝關(guān)節(jié)重度紅腫，計(jì)3分;裸關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪紅腫變形，計(jì)4分，最高每只可達(dá)16分。

2.1.3? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg的細(xì)胞比例? CFA免疫前1天、免疫后第6、10天分別麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMCs），用RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，稀釋FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體（1∶200），每個(gè)樣本2.0 μL染色30 min，冰上孵育;洗滌后，按細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞內(nèi)染色;固定破膜，洗滌3次;分別加稀釋PE標(biāo)記的抗鼠IL-17（1∶400）、Foxp3-APC（1∶300）和CD25-PE抗體（1∶400），4 ℃避光孵育30 min，洗滌，對(duì)照管加入同型對(duì)照。上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)，應(yīng)用BD Cell Quest軟件獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2? AIA風(fēng)寒濕痹大鼠JAK/STAT信號(hào)通路檢測(cè)

2.2.1? 分組與造模? 雄性SD大鼠，體質(zhì)量90～110 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AIA風(fēng)寒濕痹組，每組10只。正常對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng);AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠風(fēng)寒濕刺激14 d后，于尾根部皮下免疫含Mtb的CFA，繼續(xù)接受風(fēng)寒濕刺激6 d，風(fēng)寒濕刺激和AIA免疫方法同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞pSTAT3蛋白、CD4+IL-17+淋巴細(xì)胞pSTAT4和pSTAT6蛋白的含量? CFA免疫后14 d，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMCs，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。以稀釋后的CD4-FITC（1∶200）設(shè)門，固定破膜，根據(jù)需要，分別用稀釋后的IL-17-APC（1∶300）、pSTAT3-PE（1∶400）、pSTAT4-PE（1∶400）、pSTAT6-PE（1∶400）染色，洗滌后上機(jī)檢測(cè)。CD4+pSTAT3+蛋白平均熒光強(qiáng)度代表CD4+T細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路活化狀態(tài)。CD4+IL-17+pSTAT4+和CD4+IL-17+pSTAT6+蛋白平均熒光強(qiáng)度代表CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞JAK/STAT通路的活化狀態(tài)。

2.2.3? RT-PCR檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞中RORγt、Foxp3、STAT3、STAT4和STAT6 mRNA表達(dá)? PBMCs經(jīng)免疫磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，設(shè)計(jì)引物，其中各基因PCR引物序列見表1。Trizol提取滑膜組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量及純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以ABI自帶軟件SDS對(duì)RT-PCR進(jìn)行分析，RORγt mRNA表達(dá)水平代表Th17細(xì)胞水平，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平代表Treg細(xì)胞水平，STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)水平代表CD4+T細(xì)胞JAK/STAT通路的活化狀態(tài)。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料描述用“x±s”表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，用LSD法;方差不齊時(shí)，用Dunnett3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠外周血CD4+Th17細(xì)胞比例

免疫前1天，各組間的CD4+Th17細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在免疫后第6、10天，與正常對(duì)照組相比，單純AIA組及AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠的外周血CD4+Th17細(xì)胞比例均增加（P<0.05，P<0.01）;同時(shí)間點(diǎn)，AIA風(fēng)寒濕痹組與單純的AIA組相比，CD4+Th17細(xì)胞比例增加（P<0.05，P<0.01）。見表2。

3.2? 各組大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例 免疫前1天，各組間的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在免疫后第6、10天，與正常對(duì)照組相比，單純AIA組及AIA風(fēng)寒濕痹組大鼠的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例均降低（P<0.05，P<0.01）;同時(shí)間點(diǎn)，AIA風(fēng)寒濕痹組與單純AIA組相比，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低（P<0.05，P<0.01）。見表3。

3.3? 各組大鼠外周血CD4+pSTAT3+、CD4+IL-17+pSTAT4+和CD4+IL-17+pSTAT6+蛋白表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，AIA風(fēng)寒濕痹組外周血CD4+pSTAT3+、CD4+IL-17+pSTAT4+及CD4+IL-17+pSTAT6+蛋白表達(dá)量增加（P<0.05，P<0.01）。見表4。

3.4? 各組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞中RORγt、Foxp3

mRNA表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，AIA風(fēng)寒濕痹組外周血CD4+T細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)量降低，RORγt mRNA表達(dá)量增加（P<0.01）。見表5。

3.5? 各組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞中STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，AIA風(fēng)寒濕痹組外周血CD4+T細(xì)胞中STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)量增加（P<0.05，P<0.01）。見表6。

4 討論

RA屬于中醫(yī)“痹證”中最為常見的臨床疾患之一，是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫性疾病。RA病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其分子病理特征是以大量CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性滑膜炎癥反應(yīng)。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞新亞型，高分泌IL-17等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和延續(xù)骨破壞進(jìn)程[13]。RA患者外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例增加，而Treg細(xì)胞的比例降低，導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡，而Treg細(xì)胞通過直接接觸或產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子（如TGF-、IL-10）對(duì)自身反應(yīng)T細(xì)胞活化和增殖起負(fù)調(diào)控作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，RA風(fēng)寒濕痹大鼠存在Th17/Treg細(xì)胞失衡現(xiàn)象，風(fēng)寒濕刺激大鼠外周血CD4+Th17細(xì)胞比例較單純AIA組顯著增加（P<0.05，P<0.01），Treg細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05，P<0.01），Th17/Treg細(xì)胞比例處于失衡狀態(tài)。

有研究[16]表明，JAK/STAT信號(hào)通路活化參與RA的發(fā)生，且炎癥位點(diǎn)中的T細(xì)胞分化由JAK/STAT信號(hào)通路激活所介導(dǎo)。在樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell， APC）作用下，IL-6協(xié)同低濃度的TGF-β，激活JAK1，進(jìn)而招募STAT3，并使其磷酸化，活化的JAK1/STAT3通路激活RORγt，使初始 CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[17-18]。同時(shí)，在Th17分化的負(fù)向調(diào)節(jié)研究中，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白因子3（suppressor of cytokine signaling3， SOCS3）是重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，它通過抑制STAT3的磷酸化發(fā)揮作用[19]。RORγt被認(rèn)為是Th17細(xì)胞譜系特異性的轉(zhuǎn)錄激活因子，可誘導(dǎo)調(diào)控IL-17的高水平分泌，并抑制Treg細(xì)胞分化[20]。Th17細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄因子STAT4和STAT6調(diào)控，生成IL-17，同時(shí)可產(chǎn)生IL-23、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，IL-23可促進(jìn)激活的記憶細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，使Th17細(xì)胞得以存活和維持功能[17]。Foxp3是Treg的特異性標(biāo)志物，其持續(xù)表達(dá)是維持Treg活性的關(guān)鍵因素。研究[21-22]表明，RA患者外周血RORγt表達(dá)量顯著增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)量顯著降低。本研究結(jié)果顯示，AIA風(fēng)寒濕痹大鼠外周血RORγt表達(dá)量顯著增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)量顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示AIA風(fēng)寒濕痹大鼠Th17/Treg細(xì)胞處于失衡狀態(tài)。研究[23-24]顯示，RA患者STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)量顯著增加。本研究結(jié)果顯示，AIA風(fēng)寒濕痹大鼠外周血CD4+T細(xì)胞中STAT3、STAT4、STAT6 mRNA表達(dá)量顯著增加（P<0.05，P<0.01），RORγt和Foxp3 mRNA表達(dá)量也顯著增加（P<0.05，P<0.01），提示JAK/STAT信號(hào)通路活化并參與了炎癥位點(diǎn)中的T細(xì)胞分化。

綜上，“風(fēng)寒濕”外邪可能通過激活JAK/STAT信號(hào)通路，并在STAT3、STAT4、STAT6、RORγt及Foxp3 mRNA的參與下，激活Th17細(xì)胞分化，并抑制Treg細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

[1] SMOLEN J S， ALETAHA D， BARTON A， et al. Rheumatoid arthritis[J]. Nature Reviews Disease Primers， 2018， 4： 18001.

[2] SAFIRI S， KOLAHI A A， HOY D， et al. Global， regional and national burden of rheumatoid arthritis 1990-2017： A systematic analysis of the Global Burden of Disease study 2017[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2019， 78（11）： 1463-1471.

[3] LI Z G. A new look at rheumatology in China—opportunities and challenges[J]. Nature Reviews Rheumatology， 2015， 11（5）： 313-317.

[4] 栗占國(guó).類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎年度回顧[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（3）：4-5.

[5] 林? 也，廖? 菁，戴宗順，等.風(fēng)寒濕外邪作用于EPO影響痹證（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的發(fā)生[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（3）：345-349.

[6] 潘胡丹，劉? 良.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)治療經(jīng)驗(yàn)探討[J].中醫(yī)雜志，2016，57（2）：173-175.

[7] 吳晉英，李俊蓮，張世霞.《金匱要略》痹證探析[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19（5）：496，520.

[8] 林? 也，戴宗順，張? 婷，等.基于“以方測(cè)證”的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)寒濕痹證動(dòng)物模型的構(gòu)建研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（5）： 668-672.

[9] 李? 鑫，魏艷霞，林? 也，等.風(fēng)寒濕外邪對(duì)痹證（佐劑性關(guān)節(jié)炎）發(fā)生發(fā)展的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（12）：1496-1501.

[10] VAN EDEN W， WAKSMAN B H. Immune regulation in adjuvant-induced arthritis： Possible implications for innovative therapeutic strategies in arthritis[J]. Arthritis & Rheumatism， 2003， 48（7）： 1788-1796.

[11] 林? 也.基于以方測(cè)證的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)寒濕痹病證結(jié)合動(dòng)物模型構(gòu)建研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[12] CAI X， WONG Y F， ZHOU H， et al. The comparative study of Sprague-Dawley and Lewis rats in adjuvant-induced arthritis[J]. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology， 2006， 373（2）： 140-147.

[13] MIOSSEC P， KORN T， KUCHROO V K. Interleukin-17 and type 17 helper T cells[J]. The New England Journal of Medicine， 2009， 361（9）： 888-898.

[14] BETTELLI E， CARRIER Y， GAO W D， et al. Reciprocal

developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J]. Nature， 2006， 441（7090）： 235-238.

[15] BEHRENS F， HIMSEL A， REHART S， et al. Imbalance in distribution of functional autologous regulatory T cells in rheumatoid arthritis[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2007， 66（9）： 1151-1156.

[16] KRAUSE A， SCALETTA N， JI J D， et al. Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on Stat3[J]. Journal of Immunology， 2002， 169（11）： 6610-6616.

[17] MATHUR A N， CHANG H C， ZISOULIS D G， et al. Stat3 and Stat4 direct development of IL-17-secreting Th cells[J]. Journal of Immunology （Baltimore， Md ： 1950）， 2007， 178（8）： 4901-4907.

[18] WU H X， YAN S X， CHEN J Y， et al. JAK1-STAT3 blockade by JAK inhibitor SHR0302 attenuates inflammatory responses of adjuvant-induced arthritis rats and decreases Th17 and total B cells[J]. Joint Bone Spine， 2016， 83（5）： 525-532.

[19] KIM E K， KWON J E， LEE S Y， et al. IL-17-mediated mitochondrial dysfunction impairs apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through activation of autophagy[J]. Cell Death & Disease， 2017， 8（1）： e2565.

[20] KLUGER M A， NOSKO A， RAMCKE T， et al. RORγt expression in Tregs promotes systemic lupus erythematosus via IL-17 secretion， alteration of Treg phenotype and suppression of Th2 responses[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2017， 188（1）： 63-78.

[21] SUN H Q， GAO W W， PAN W P， et al. Tim3+Foxp3+ tregcells are potent inhibitors of effector T cells and are suppressed in rheumatoid arthritis[J]. Inflammation， 2017， 40（4）： 1342-1350.

[22] KANEKO S， KONDO Y， YOKOSAWA M， et al. The RORγt-CCR6-CCL20 axis augments Th17 cells invasion into the synovia of rheumatoid arthritis patients[J]. Modern Rheumatology， 2018， 28（5）： 814-825.

[23] WALKER J G， AHERN M J， COLEMAN M， et al. Expression of Jak3， STAT1， STAT4， and STAT6 in inflammatory arthritis： Unique Jak3 and STAT4 expression in dendritic cells in seropositive rheumatoid arthritis[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2006， 65（2）： 149-156.

[24] 呂? 卓，李? 娟，馮知濤，等.RA患者外周血HLA-DR4、PAD4、STAT4 mRNA表達(dá)及與疾病活動(dòng)的相關(guān)性[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（6）：1349-1353.

（本文編輯? 匡靜之 周? 旦）