吳源陶，鄒譯嫻，張春虎，王理槐

〔摘要〕 目的 探討菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）對人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖、凋亡和自噬的影響。方法 將HT-29細(xì)胞分為對照組（DMEM培養(yǎng)液）和SAR組（DMEM培養(yǎng)液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液）;分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL染色及MDC染色檢測細(xì)胞的增殖、凋亡及自噬的變化情況;用Western blot法檢測細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 經(jīng)SAR處理后，HT-29細(xì)胞的增殖能力明顯降低（P<0.05），凋亡和自噬水平明顯增加（P<0.05）;與對照組相比，SAR組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 SAR能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的發(fā)生，其機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 菝葜皂苷元;結(jié)腸癌;大腸癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞自噬

〔中圖分類號〕R273? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.001

Effect of Sarsasapogenin on Apoptosis and Autophagy of Colorectal Cancer Lines HT-29

WU Yuantao1， ZOU Yixian1， ZHANG Chunhu2， WANG Lihuai1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chines Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of sarsasapogenin （SAR） on the proliferation， apoptosis， and autophagy of human colorectal cancer cell HT-29. Methods HT-29 cells were divided into control group （DMEM medium） and SAR group （DMEM medium + DMSO + 10， 20， 30， 40， 50， 60 mg/L SAR solution）. MTT， flow cytometry， TUNEL staining， and MDC staining were used to detect the changes of cell proliferation， apoptosis and autophagy; Western blot method was used to detect the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein. Results After treatment with SAR， the proliferation ability of HT-29 cells was significantly reduced （P<0.05）， and the level of apoptosis and autophagy increased significantly （P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein in SAR group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion SAR can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells， induce apoptosis and autophagy. The mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein expression levels.

〔Keywords〕 sarsasapogenin; colon cancer; colorectal cancer; cell proliferation; apoptosis; autophagy

結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第三位[1]。我國CRC的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢[2]。最新的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，CRC在我國惡性腫瘤發(fā)病率中位列第三[3]。菝葜，又名金剛藤，為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，其主要成分是皂苷，且是以菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）為主要苷元所衍生的皂苷。研究[4]表明，SAR具有抗衰老、抗炎、降血糖等作用。近年來研究[5]報道，SAR還可用于抗腫瘤，如肝癌、胃癌等。但是，關(guān)于SAR對CRC的作用及其機(jī)制的研究報道甚少。因此，本研究擬以CRC細(xì)胞株HT-29為研究對象，通過觀察菝葜提取物對CRC細(xì)胞株HT-29凋亡和自噬的影響，探討菝葜提取物對CRC的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 細(xì)胞株

人CRC細(xì)胞HT-29（批號：SCSP-5032）購于上海生物科學(xué)研究所，在含10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其內(nèi)加入雙抗，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2? 試劑與儀器

SAR（海億欣生物科技公司，批號：B20025）;DMEM培養(yǎng)基（批號：12491015）、胎牛血清（批號：10099-141-FBS）均購自美國GIBCO公司;二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（美國Sigma公司，批號：67-68-5）;Caspase-3抗體（批號：9669）、Caspase-9抗體（批號：9504）、Beclin-1抗體（批號：3738）、LC3B抗體（批號：2775）均購自美國CST公司。

超凈工作臺（蘇州凈化公司，型號：SW-CJ-IFD）;二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號：Shellab 2306）;流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter Inc公司，型號：Cytomics FC500）;全自動酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司，型號：MR-96A）;實時定量 PCR 儀（美國 BioRad公司，型號：S1000）;離心機(jī)（美國Thermo公司，型號：Medifuge）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司，型號：BX-51）。

1.3? 細(xì)胞分組

將HT-29細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/孔接種在96孔板培養(yǎng)24 h。分為對照組（DEME培養(yǎng)液）和SAR組（DMEM培養(yǎng)液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液），各組培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4? MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

取狀態(tài)良好、生長旺盛的HT-29細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞;以1×105/孔細(xì)胞密度接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)4 h后分別加入10、20、30、40、50、60 mg/L的SAR，對照組不加藥;藥物處理24、48、72 h后，開始MTT反應(yīng)，酶標(biāo)儀490 nm檢測OD值。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5? 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

將50 mg/L SAR加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞變圓時，終止消化，依次以預(yù)冷的D-Hanks液及1×binding buffer洗滌細(xì)胞。離心重懸成細(xì)胞懸液。添加10 μL

Annexin V-APC染色液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同組別細(xì)胞的凋亡率。

1.6? MDC染色檢測細(xì)胞自噬

取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，重懸成細(xì)胞懸液。加入50 mg/L SAR培養(yǎng)，2 h后加入6-OHDA，共培養(yǎng)48 h，對照組不加藥，常規(guī)培養(yǎng)。后按照MDC染色試劑盒操作說明進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)并拍照。檢測到的高亮點狀熒光代表自噬泡。

1.7? Western blot檢測蛋白表達(dá)量

用胰酶消化并收集處于對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，加入SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白，后采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉液室溫封1 h;用TBST洗膜3次后，加入用TBST稀釋的一抗（Caspase-3為1∶500;Caspase-9為1∶1 000;Beclin-1為1﹕1 000;LC3B為1∶1 000），4 ℃過夜;用TBST洗膜3次，每次5 min;經(jīng)TBST漂洗后加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次;加ECL顯影劑，用自動凝膠成像分析儀檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用“x±s”表示。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，組間比較采用one-way ANOVA分析。若方差齊，組間差異比較采用LSD法;若方差不齊，組間差異比較采用Tamhane法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? SAR對HT-29細(xì)胞生長抑制的影響

SAR能夠抑制HT-29細(xì)胞的增殖，且對細(xì)胞增殖的抑制作用呈時間和濃度依賴性。與0 mg/L相比，用50 mg/L SAR干預(yù)48 h后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P<0.05）。因此選取50 mg/L SAR進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2? SAR對HT-29細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，SAR組細(xì)胞早期凋亡率為3.24%，高于對照組細(xì)胞早期凋亡率的0.41%（P<0.05）;SAR組細(xì)胞晚期凋亡率為14.36%，高于對照組細(xì)胞晚期凋亡率的0.66%（P<0.05）。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，SAR組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多（P<0.05）。見圖2。

2.3? SAR對HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對照組相比，SAR組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。見圖3。

2.4? SAR對HT-29細(xì)胞自噬的影響

與對照組相比，SAR組可見到明顯的自噬囊泡形成。見圖4。

2.5? SAR對HT-29細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

與對照組相比，SAR組細(xì)胞Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)增多（P<0.05）。見圖5。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，CRC已成為全球第四大致命癌癥[6]。根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的《2018年國家癌癥報告》顯示，CRC在中國癌癥發(fā)病率中排名第三[3]。因此，迫切需要尋找一種有效治療CRC的臨床藥物[7]。SAR可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，且由于其較高的安全性，使SAR的抗CRC癌活性已成為國內(nèi)外研究的熱點之一[5]。

凋亡是細(xì)胞為清除體內(nèi)異?；蚴軗p細(xì)胞自發(fā)啟動的程序性保護(hù)機(jī)制，在細(xì)胞發(fā)育和代謝中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。臨床上通過外部干預(yù)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為治療腫瘤的重要途徑。有學(xué)者探討了SAR對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)SAR能夠誘導(dǎo)HepG2凋亡[9-10]。廖子君等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)，SAR能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡，而不會影響健康細(xì)胞的生長，同時能夠上調(diào)Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAR組HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）。TUNEL染色結(jié)果同樣提示SAR可以誘導(dǎo)人CRC HT-29細(xì)胞凋亡（P<0.05）。進(jìn)一步對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，SAR干預(yù)可上調(diào)HT-29細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)（P<0.05）。凌博凡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SAR干預(yù)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)發(fā)生的同時線粒體膜電位會出現(xiàn)下調(diào)改變，提示誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與線粒體通路的調(diào)控有關(guān)。

自噬是真核生物體細(xì)胞內(nèi)重要的自我降解和再循環(huán)機(jī)制。生理狀態(tài)下，自噬通過清除自身有害物質(zhì)（老化及死亡的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器）而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對機(jī)體細(xì)胞發(fā)揮著保護(hù)作用[14-15]。當(dāng)自噬發(fā)生異常時，細(xì)胞內(nèi)原有的穩(wěn)態(tài)會被打破，而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[16-17]。Beclin-1基因是自噬的特異性相關(guān)基因，由其編碼的Beclin-1蛋白被認(rèn)為是腫瘤抑制蛋白，能夠調(diào)節(jié)自噬過程，其機(jī)制可能是與ClassⅢPI3K相結(jié)合參與自噬泡的形成[18]。LC3B作為細(xì)胞自噬的特異性蛋白，其含量與自噬小體數(shù)量呈正相關(guān)，因而被廣泛運(yùn)用于自噬研究[19-20]。本研究運(yùn)用MDC染色法研究SAR對細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，SAR組可見到明顯的自噬囊泡，且經(jīng)SAR處理的HT-29細(xì)胞中，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B顯著增多（P<0.05），提示SAR可激活HT-29細(xì)胞的自噬。

綜上所述，SAR可能通過調(diào)控Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白的表達(dá)水平發(fā)揮抑制HT-29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的作用。但是其具體深層機(jī)制需后續(xù)實驗進(jìn)一步進(jìn)行研究。本研究為菝葜皂苷的進(jìn)一步開發(fā)和為CRC的臨床治療提供了有力的實驗證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2020[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2020， 70（1）： 7-30.

[2] 曹? 文，周小青.濕熱-痰結(jié)-瘀毒型小鼠腸癌模型的建立[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（1）：38-41.

[3] BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mort？鄄

ality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018， 68（6）： 394-424.

[4] 王江威，蘇曉琳，鄭秀茜，等.中藥菝葜的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].化學(xué)工程師，2020，34（2）：50-53.

[5] 宋? 宇，梁長青，何忠梅，等.薯蕷皂苷元體外抗腫瘤作用的研究[J]. 中國腫瘤，2004，13（10）：41-43.

[6] CHENG L， ENG C， NIEMAN L Z， et al. Trends in colorectal cancer incidence by anatomic site and disease stage in the United States from 1976 to 2005[J]. American Journal of Clinical Oncology， 2011， 34（6）： 573-580.

[7] DEKKER E， TANIS P J， VLEUGELS J L A， et al. Colorectal cancer[J]. The Lancet， 2019， 394（10207）： 1467-1480.

[8] FERNALD K， KUROKAWA M. Evading apoptosis in cancer[J]. Trends in Cell Biology， 2013， 23（12）： 620-633.

[9] XU X B， LAI Y Y， HUA Z C. Apoptosis and apoptotic body： Disease message and therapeutic target potentials[J]. Bioscience Reports， 2019， 39（1）： BSR20180992.

[10] BAO W N， PAN H F， LU M， et al. The apoptotic effect of sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides on HepG2 human

hepatoma cells[J]. Cell Biology International， 2007， 31（9）： 887-892.

[11] 倪? 源.菝葜皂苷元致肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用機(jī)理的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2008.

[12] 廖子君，鄭? 琪，趙? 征，等.菝葜皂苷對胃癌BGC-823細(xì)胞Bcl-2、Bax凋亡蛋白表達(dá)影響的實驗研究[J].中國醫(yī)藥指南，2018，16（18）：1-2.

[13] 凌博凡，鄒? 璽，吳? 堅，等.菝葜皂苷元對人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo凋亡的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，28（3）：256-258.

[14] NODA N N， INAGAKI F. Mechanisms of autophagy[J]. Annual Review of Biophysics， 2015， 44： 101-122.

[15] RAVANAN P， SRIKUMAR I F， TALWAR P. Autophagy： The spotlight for cellular stress responses[J]. Life Sciences， 2017， 188： 53-67.

[16] ONORATI A V， DYCZYNSKI M， OJHA R， et al. Targeting autophagy in cancer[J]. Cancer， 2018， 124（16）： 3307-3318.

[17] MARINKOVI M， PRUNG M， BULJUBA I M， et al. Autophagy

modulation in cancer： Current knowledge on action and therapy[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2018， 2018： 8023821.

[18] DU H L， CHE J M， SHI M M， et al. Beclin 1 expression is associated with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncology Letters， 2017， 14（6）： 6823-6828.

[19] GIATROMANOLAKI A， KOUKOURAKIS M I， GEORGIOU I， et al. LC3A， LC3B and beclin-1 expression in gastric cancer[J]. Anticancer Research， 2018， 38（12）： 6827-6833.

[20] CERULLI R A， SHEHAJ L， BROWN H， et al. Stapled peptide inhibitors of autophagy adapter LC3B[J]. ChemBioChem， 2020， 21（19）： 2777-2785.

（本文編輯? 匡靜之 周? 旦）