鄧楚欣，于征淼，林培政，吳智兵

〔摘要〕 目的 使用與運動平衡、自主活動及空間工作記憶功能相關(guān)的行為學(xué)測試，觀察半夏生物總堿（pinellia total alkaloids，PTA）對健康雄性小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的運動和認(rèn)知功能的抑制作用，從而評價PTA的神經(jīng)毒性。方法 限量試驗取30例4周齡雄性KM小鼠，隨機分為PTA組（2 g/kg）和空白組，每組15只，灌胃1次，在灌胃前（0 h）和灌胃后8 h、7 d、14 d進(jìn)行轉(zhuǎn)棒測試及Y臂迷宮測試。28 d重復(fù)劑量試驗取60例4周齡雄性KM小鼠，隨機分為PTA低、中、高劑量組（0.08、0.28、1 g/kg）及空白組，每組15只，連續(xù)灌胃28 d;在首劑灌胃前（0 h）和首劑灌胃后14 d、28 d、35 d進(jìn)行轉(zhuǎn)棒測試及Y臂迷宮測試。取腦和脊髓組織行HE染色病檢，觀察額葉、尾狀核、海馬、黑質(zhì)、腦橋、小腦及脊髓前角的組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 限量測試：與空白組比，PTA組體質(zhì)量在7 d和14 d較高（P<0.05），Y臂迷宮的自發(fā)路線轉(zhuǎn)換行為比（SAB%）在8 h升高（P<0.05）。28 d重復(fù)劑量試驗：與自身0 h比，PTA高劑量組的SAB%在28 d升高（P<0.05）。病檢未見明顯異常。結(jié)論 在本研究的給藥方案及評價指標(biāo)下，PTA未對雄性小鼠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性，個別時間點出現(xiàn)的行為學(xué)水平提高的意義尚不明確。

〔關(guān)鍵詞〕 半夏生物總堿;神經(jīng)毒性;運動平衡;自主活動;空間工作記憶;病理;小鼠

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.006

Effect of Pinellia Total Alkaloids on Motor Coordination， Locomotion， and Spatial

Working Memory on Healthy Mice

DENG Chuxin1， YU Zhengmiao1， LIN Peizheng2， WU Zhibing1*

（1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China;

2. Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510000， China）

〔Abstract〕 Objective Neurotoxicity evaluation concerning motor and cognitive inhibition of pinellia total alkaloids （PTA） on healthy mice was conducted by using behavioral tests related to motor coordination， locomotion， and spatial working memory. Methods In the limit test， 30 male KM mice （4 weeks old） were divided into a PTA group （2 g/kg） and a control group， with 15 mice in each group， and were intragastrically dosed once. The rotarod test （RT） and the Y-maze test （YMT） were examined before dosing （0 hour） and at 8 hours， 7 and 14 days after dosing. In the repeated 28-day dosing test， 60 male KM mice （4 weeks old） were assigned to the PTA low， medium， and high dose （0.08， 0.28， 1 g/kg） groups and the control group， with 15 mice in each group. Mice were intragastrically dosed once daily for 28 days. The RT and YMT were examined before the first dose （0 hour） and at 14， 28 and 35 days after the first dose. HE staining was conducted on sections of the frontal motor cortex， caudate putamen， hippocampal formation， substantia nigra， pons， cerebellum cortex， and ventral horns of the spinal cord. Results In the limit test， compared with the control group， the PTA group showed higher body weight at 7 and 14 days （P<0.05）， and higher spontaneous alternation behavior （SAB%） at 8 hours （P<0.05）. In the repeated 28-day dosing test， compared with 0 hour， the PTA high dose group showed higher SAB% at 28 days （P<0.05）. No significant histopathological changes were observed. Conclusion With the dosing regimens and indicators used in this study， PTA did not induce significant neurotoxicity in healthy male mice， the significance of increased behavioral responses detected in certain time points remained undefined.

〔Keywords〕 pinellia total alkaloids; neurotoxicity; motor coordination; locomotion; spatial working memory; histopathology; mice

半夏（Pinelliae Rhizoma）性味辛溫，有燥濕化痰、降逆止嘔和消痞散結(jié)等功效，臨床中常用于治療各種痰證，如癇病、痰喘咳嗽、風(fēng)痰眩暈和痰濕嘔逆等。半夏復(fù)雜的成分中含有生物堿、半夏蛋白、辛辣性醇類、有機酸類、多糖、甾醇類、氨基酸、揮發(fā)油及無機元素等[1]?，F(xiàn)代研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，半夏生物總堿（pinellia total alkaloids， PTA）對多種癲癇模型的腦部癇性放電及運動性癇性發(fā)作癥狀展現(xiàn)出顯著的抗癇作用，提示PTA可能是半夏的主要抗癇成分。

抗癇藥物必須進(jìn)行神經(jīng)毒性篩查，一是鑒別藥物對癇性發(fā)作的抑制作用是直接的抗癇作用還是對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，比如通過損害運動系統(tǒng)而掩蓋癇性發(fā)作癥狀;二是如果藥物確實存在神經(jīng)毒性，則需評估毒性的性質(zhì)、范圍、強度及可逆性等[6-7]。初篩試驗首選無創(chuàng)的神經(jīng)行為學(xué)測試指標(biāo)，以定量反映藥物對認(rèn)知、運動、感覺和自主神經(jīng)等神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響[8]。當(dāng)行為學(xué)測試提示存在神經(jīng)毒性時，再進(jìn)一步行組織病理學(xué)、電生理學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和神經(jīng)免疫學(xué)等指標(biāo)檢測[9]。

研究[1]顯示，PTA可能存在鎮(zhèn)靜催眠和中樞止嘔等除抗癇作用以外的中樞抑制作用，提示在深入研究PTA對癲癇的治療作用前有必要對其進(jìn)行神經(jīng)毒性篩查。本研究前期試驗[9-10]發(fā)現(xiàn)，PTA對雄性SD大鼠的經(jīng)口半數(shù)致死量>2 g/kg（擴展試驗法），測試期間大鼠未見病態(tài)，考慮PTA的經(jīng)口毒性可能不大。因此，本研究選擇限量試驗和28 d重復(fù)劑量試驗這兩種常用的經(jīng)口毒性測試方案。指標(biāo)方面，用轉(zhuǎn)棒測試篩查PTA對運動平衡能力的影響，用Y臂迷宮-自發(fā)路線轉(zhuǎn)換測試篩查PTA對自主活動量及空間工作記憶能力的影響。當(dāng)行為學(xué)測試提示異常時，選取與運動和認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)病檢。

1 材料

1.1? 動物

SPF級雄性KM小鼠90只，體質(zhì)量18～22 g，4周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[許可證：SCXK（粵）2013-0034]，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗室[實驗動物環(huán)境、設(shè)施使用合格證：SYXK（粵）2013-0092]，自由取食SPF級飼料及水。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，期間進(jìn)行適應(yīng)性觸摸。實驗設(shè)計及執(zhí)行符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會規(guī)定。

1.2? 主要藥品、試劑及儀器

PTA粉劑（南京道斯夫生物科技有限公司，貨號：170325R）;水合氯醛（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，貨號：I19957），溶于0.9%氯化鈉注射液（normal saline， NS）（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，貨號：A17011607-1）;4%多聚甲醛（Paraformaldehyde， PFA）溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號：1129A17）;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining， HE）染液（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G1005）;Y臂迷宮由黑色有機玻璃制成（佛山市富惠廚房設(shè)備有限公司），有3條外觀一致的、頂面開放的長方體型臂（各臂長50 cm、寬10 cm、高25 cm），分別命名為A臂、B臂和C臂;ZB200-6通道疲勞轉(zhuǎn)棒儀（成都泰盟科技有限公司）;FDR-AX40 Sony■高清攝像機（上海索廣電子有限公司）固定在Y臂迷宮中心的正上方。

2 方法

2.1? 分組、給藥及取材

適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行首次行為學(xué)測試。限量試驗取30只雄性KM小鼠，分為PTA組（2 g/kg）和空白組（純水），灌胃1次，觀察14 d，隨后取材。28 d重復(fù)劑量試驗取60只雄性KM小鼠，分為PTA低、中、高劑量組（0.08、0.28、1 g/kg）及空白組（純水），連續(xù)28 d每天灌胃1次，然后每組取材6只小鼠，其余小鼠觀察至35 d后取材。灌胃量為8 mL/（kg·次）。取材時予腹腔注射7%水合氯醛（0.55 g/kg），然后進(jìn)行原位灌注：先從升主動脈灌入4 ℃的NS 120 mL，再灌入4 ℃的4% PFA 60 mL，留取全腦及脊髓。

2.2? 監(jiān)測指標(biāo)

2.2.1? 一般情況? 每天兩次記錄小鼠的健康狀態(tài)（皮膚毛發(fā)、個體及群居活動、運動狀態(tài)及排便情況等），每周稱重1次。

2.2.2? 行為學(xué)? 限量試驗在灌胃前（0 h）和灌胃后8 h內(nèi)、7 d、14 d測行為學(xué)。28 d重復(fù)劑量試驗在首劑灌胃前（0 h）和首劑灌胃后14 d、28 d、35 d測行為學(xué)。轉(zhuǎn)棒測試[10]：首先進(jìn)行訓(xùn)練，將小鼠放到轉(zhuǎn)速為4 r/min的轉(zhuǎn)棒上保持平衡60 s，訓(xùn)練3次，如第3次訓(xùn)練時小鼠能保持平衡60 s不掉落即符合進(jìn)入正式實驗的要求。每次正式測試前需進(jìn)行1次儀器適應(yīng)，將小鼠放到轉(zhuǎn)速為4 r/min的轉(zhuǎn)棒上保持平衡60 s不掉落即可，10 min后進(jìn)行正式測試。每次的正式測試需進(jìn)行3輪，每輪的測試方法一致：將小鼠放到初速為4 r/min的轉(zhuǎn)棒上，每10 s加速1 r/min，最高加到50 r/min，當(dāng)小鼠掉落時，該輪測試結(jié)束，記錄掉落潛伏期（latency to fall， LTF），間隔15～20 min后進(jìn)行下一輪測試，3輪測試后取LTF的平均值。Y臂迷宮-自發(fā)路線轉(zhuǎn)換測試[11]：小鼠從3條臂中的某一條進(jìn)入活動場并自由探索5 min，測試期間實驗員離場，過程由攝像機拍攝，作為采集數(shù)據(jù)的依據(jù)。記錄每條臂的進(jìn)入次數(shù)和自發(fā)路線轉(zhuǎn)換行為（spontaneous alternation behavior， SAB）次數(shù)。當(dāng)小鼠的運動路線連續(xù)包括3條不同的臂時記錄為1次SAB，如果活動路線為B臂→A臂→C臂→A臂→C臂→B臂→B臂→A臂→C臂，則SAB有3次（BAC-ACB-BAC）[11]。

SAB%=[SAB次數(shù)/（總進(jìn)入臂次數(shù)-2）]×100%[11-12]

2.2.3? 組織病檢? 限量試驗中每組取6只小鼠進(jìn)行病檢。28 d重復(fù)劑量試驗中空白組和PTA高劑量組在28 d后每組取6只小鼠進(jìn)行病檢，如有陽性發(fā)現(xiàn)，再進(jìn)行其他組別的和35 d后取得的組織病檢。經(jīng)4% PFA固定的腦及脊髓組織進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色及脫水封片。腦組織取Bregma1.5、-2.0、-2.5、-5.5 mm（L1、L2、L3、L4） 4個區(qū)域進(jìn)行冠狀切片[13]。L1主要觀察額頂葉皮層和尾狀核，與學(xué)習(xí)、行為和肢體活動有關(guān);L2主要觀察海馬結(jié)構(gòu)，與行為學(xué)表現(xiàn)（如空間工作記憶）有關(guān);L3主要觀察黑質(zhì)，與運動協(xié)調(diào)性有關(guān);L4主要觀察腦橋和小腦皮質(zhì)，與姿勢步態(tài)和運動平衡能力有關(guān)[13]。脊髓在頸、胸及腰等3個區(qū)域進(jìn)行橫軸切片，主要觀察脊髓前角，與肢體活動有關(guān)。玻片在IX3-RFACS顯微鏡（Olympus）下觀察并拍攝。頸髓及腰髓在雙側(cè)前角各拍攝1個視野（×200），胸髓的雙側(cè)前角拍攝在1個視野下（×200）;對視野中的膠質(zhì)細(xì)胞增生程度進(jìn)行評級：膠質(zhì)細(xì)胞在視野中的面積占比為0%，1%～25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%時，分別為0、1、2、3、4分。

2.3? 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以“x±s”表示，符合正態(tài)分布者進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析，多組間的兩兩比較選擇Bonferroni法（方差齊時）或Games-Howell法（方差不齊時）;不符合正態(tài)分布者進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗;對于兩個或多個獨立樣本的、服從正態(tài)分布的重復(fù)測量資料（測量次數(shù)≥3次），進(jìn)行重復(fù)測量資料的方差分析，組間數(shù)據(jù)的多重比較選擇Bonferroni法。P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? PTA對小鼠一般健康狀態(tài)及體質(zhì)量的影響

給藥期間各組小鼠的一般健康狀態(tài)良好，毛發(fā)光亮、潔白整齊，個體及群居活動如常，一般肢體活動及排便情況亦未見明顯異常。PTA高劑量組有1只小鼠因人為意外死亡，不納入統(tǒng)計分析。限量測試中，與空白組比較，PTA組7 d（P<0.05）和14 d（P<0.05）的體質(zhì)量較高（見表1）。28 d重復(fù)劑量試驗中，與空白組比較，給藥期間（0 h～28 d）PTA低劑量組的體質(zhì)量增長較慢（P<0.05），但實驗全程（0 h～35 d）各組之間的體質(zhì)量增長差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3.2? PTA對小鼠運動平衡能力的影響

限量測試中，與空白組比，PTA組8 h、7 d、14 d的LTF較低（P>0.05）;與0 h比，空白組8 h （P<0.01）、7 d（P<0.01）、14 d（P<0.01）的LTF較高，PTA組8 h、7 d、14 d的LTF也較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見表3）。28 d重復(fù)劑量試驗中，與空白組比，PTA低、中、高劑量組在14、28、35 d的LTF未見顯著降低（P>0.05）。見表4。

3.3? PTA對小鼠自主活動量及空間工作記憶能力的影響

限量試驗及28 d重復(fù)劑量試驗期間各組的總進(jìn)入臂次數(shù)有所波動，但組間比較未顯示出某種固定的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。限量試驗中，與空白組比，PTA組8 h的SAB%升高（P<0.05）;與本組0 h比，PTA組7 d（P<0.01）和14 d（P<0.01）的SAB%下降。28 d重復(fù)劑量試驗中，與自身0 h比，PTA高劑量組28 d的SAB%升高（P<0.05），但與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表5-8。

3.4? PTA對小鼠組織形態(tài)的影響

4組小鼠的額葉運動皮層見大量錐體細(xì)胞分布，周圍見散在分布的膠質(zhì)細(xì)胞;尾狀核結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維網(wǎng)緊湊豐富;海馬結(jié)構(gòu)中齒狀回顆粒細(xì)胞層和海馬CA3、CA2及CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整，呈帶狀分布，周圍有少許膠質(zhì)細(xì)胞分布;黑質(zhì)核團及神經(jīng)纖維網(wǎng)完整;第4腦室底部腦橋結(jié)構(gòu)完整，核團清晰可見;小腦皮質(zhì)可見清晰的分子層、浦肯野細(xì)胞層及顆粒層，各層中優(yōu)勢細(xì)胞排列整齊;以上結(jié)構(gòu)血管及血管周圍腔腔徑適中，未見明顯的病變（見圖1-2）。4組小鼠的頸髓、胸髓及腰髓的前角可見運動角細(xì)胞，白質(zhì)纖維的分布及中央管的室管膜上皮的形態(tài)正常，可見不同程度的膠質(zhì)細(xì)胞增生（見圖2），但限量試驗及28 d重復(fù)劑量試驗中空白組與PTA給藥組的膠質(zhì)細(xì)胞增生程度在組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表9-10。

4 討論

經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development）發(fā)布的嚙齒類動物神經(jīng)毒性測試指南將神經(jīng)毒性定義為任何與治療有關(guān)的、由治療導(dǎo)致的某個器官的生存能力、再生能力及對環(huán)境的適應(yīng)能力下降到基線水平以下的作用[14]。由此可知，神經(jīng)毒性的評價并非簡單的“有或無”，而是對藥物存在的或潛在的神經(jīng)毒性作用進(jìn)行評估?？拱B藥物（anti-epileptic drugs， AEDs）的急毒作用多為神經(jīng)毒性，在嚙齒類動物上常表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜和運動系統(tǒng)功能下降[15]。但是，AEDs在發(fā)揮作用時必然會產(chǎn)生中樞抑制作用，因此在判斷藥物的神經(jīng)毒性時應(yīng)該更加慎重;把不同程度的意識水平或活動功能下降都稱為“毒性”是不合理的。從常見的AEDs不良反應(yīng)來猜測，其神經(jīng)毒性可能會表現(xiàn)為不可逆地降低認(rèn)知、運動和感覺等能力，或產(chǎn)生廣泛的抑制作用后使合并其它不良結(jié)局的風(fēng)險增大（如服藥后出現(xiàn)嗜睡）[9]。

轉(zhuǎn)棒測試是神經(jīng)毒性初篩試驗的首選指標(biāo)之一[7]，而本研究使用的“加速方案”比既往的“定速方案”能更敏感地發(fā)現(xiàn)動物運動平衡能力的細(xì)微差異[11]。Y臂迷宮測試是藥理研究的常用行為學(xué)測試方案之一[16]。其中，SAB%可反映由海馬結(jié)構(gòu)主導(dǎo)的空間工作記憶能力，該能力還與丘腦、新皮質(zhì)和基底核等區(qū)域的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有關(guān);總進(jìn)入臂次數(shù)則反映動物的自主活動活躍程度;另外，本試驗還能用于評估藥物的膽堿能抑制作用及多巴胺能和5-羥色胺能的激活作用[11，16]。

在本研究的給藥方案下，PTA未對雄性小鼠的一般健康狀態(tài)和自主活動量產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響。PTA單次大劑量給藥與重復(fù)較低劑量給藥似乎對小鼠的體質(zhì)量產(chǎn)生了不同趨勢的影響（大劑量增加體質(zhì)量，較低劑量減少體質(zhì)量），提示這兩種給藥方案可能對小鼠的體質(zhì)量產(chǎn)生了不同機制的作用（如延長給藥時間可能會導(dǎo)致藥物作用累積、敏化或耐受）。但以上發(fā)現(xiàn)尚不確切，因28 d重復(fù)劑量試驗的中、高劑量組未發(fā)現(xiàn)類似的體質(zhì)量增減，即量效關(guān)系不顯著;另外，體質(zhì)量受較多混雜因素的影響，單純的體質(zhì)量上升或下降并不能直接說明藥物的毒性作用。PTA單劑（2 g/kg）及28劑（0.08、0.28、1 g/kg）給藥后小鼠轉(zhuǎn)棒測試LTF的增速較低，但未見量效關(guān)系，與空白組比較未得出統(tǒng)計學(xué)差異，而且停藥后變化不明顯;提示PTA可能對小鼠的運動平衡能力存在一定的降低作用，但該作用暫未能定義為神經(jīng)毒性。另外，PTA單劑（2 g/kg）在給藥后8 h內(nèi)，測得Y臂迷宮的SAB%出現(xiàn)短暫升高，在7 d和14 d復(fù)測的SAB%雖較前下降，但與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異;類似情況可見于PTA（1 g/kg）給藥28 d后SAB%高于自身給藥前，但與空白組比較亦無統(tǒng)計學(xué)差異。盡管SAB%反映動物的空間工作記憶能力，但這兩組中出現(xiàn)的單發(fā)的SAB%升高暫不能解讀為“空間工作記憶能力提高”。首先，這種情況僅見于兩個PTA給藥組的某個測試時間點;另外，某些腦區(qū)通過控制正常風(fēng)險探索行為而對學(xué)習(xí)速度起調(diào)控作用，當(dāng)這些區(qū)域受損時、可能表現(xiàn)為學(xué)習(xí)速度的異常提高[17]。

基于以上的可疑陽性發(fā)現(xiàn)，本研究參考美國國家毒理部對神經(jīng)毒性研究的病理切片要求[13]，進(jìn)一步對與運動系統(tǒng)及空間工作記憶相關(guān)的腦區(qū)進(jìn)行病理鏡檢。病檢包含的額葉運動皮層、尾狀核、海馬結(jié)構(gòu)、黑質(zhì)、腦橋、小腦皮層和脊髓運動前角均未發(fā)現(xiàn)顯著的病變，即PTA未對以上結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的毒性作用。因此，我們推測行為學(xué)測試的可疑陽性發(fā)現(xiàn)可能是：（1）與PTA無關(guān)的偶然波動;（2）與PTA有關(guān)的一過性功能性改變;（3）病檢部位未覆蓋到某些罕見的小灶病變區(qū)域。

綜上所述，在本研究的給藥方案及評價指標(biāo)下，PTA未對雄性小鼠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性，同時亦未對小鼠產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)抑制性作用，個別時間點出現(xiàn)的行為學(xué)水平提高的意義尚不明確。

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