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間充質(zhì)干細胞在眼表疾病治療中的應用

2021-11-30 15:39張暖羅曉慧綜述梁凌毅審校
眼科學報 2021年4期
關鍵詞:眼表免疫調(diào)節(jié)充質(zhì)

張暖,羅曉慧 綜述 梁凌毅 審校

(中山大學中山眼科中心角膜與眼表疾病科,眼科學國家重點實驗室,廣州 510060)

眼表的概念由Thoft[1]在1977年首次提出,主要包括角膜上皮、結膜上皮和淚膜3個部分。眼表直接與外界環(huán)境接觸,是眼球的首道屏障,因此對維持眼部健康和眼球內(nèi)部穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。眼表疾病是指導致眼表結構異常或功能障礙的疾病,是眼科最常見的疾病之一。目前臨床的治療方法包括局部使用眼藥水、全身使用抗生素以及手術治療,然而對于一些難治性或反復性的疾病,如角膜移植排斥、干眼、角膜化學傷等,其治療效果并不理想。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem/stromal cells,MSCs)是一類源于多種組織的,包括骨髓(bone marrow derived-,BM-),脂肪(adipose tissue derived-,AT-),臍帶血來源(umbilical cord derived-,UC-)、牙齦(gingival derived-)、臍帶膠質(zhì)(Wharton’s jelly mesenchymal derived-)等的、非造血的、形似成纖維細胞紡錘狀的、具有強大自我更新能力及在不顯著改變性能的情況下保持多次傳代的細胞[2-3]。近年來,其免疫調(diào)節(jié)、組織修復、抗新生血管、定向損傷組織遷移的特性受到廣泛關注。

1 間充質(zhì)干細胞的作用機制

1.1 作用機制

迄今為止,MSCs治療疾病的確切機制仍不清楚,以下是目前提出的幾種可能的治療機制。

1.1.1 免疫調(diào)節(jié)機制

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能抑制和改善多種免疫性疾病的異常炎癥的作用[4]。MSCs可調(diào)控多種免疫細胞的成熟和功能,例如樹突狀細胞[5]、自然殺傷細胞[6]、巨噬細胞、T淋巴細胞[7-8]和B淋巴細胞[9],調(diào)節(jié)機體的先天性和獲得性免疫反應。MSCs對免疫細胞的調(diào)節(jié)主要與之分泌的一系列細胞因子有關,包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β1,TGF-β1)、前列腺素E2、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、金屬基質(zhì)蛋白酶、血紅素氧合酶-1和一氧化氮等[10-11]。MSCs還高表達一系列黏附分子和趨化因子,包括細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1和趨化因子受體3等,誘導免疫細胞與MSCs緊密靠近,形成具有局部免疫抑制作用的微環(huán)境[12]。此外,MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能被認為是可調(diào)節(jié)的,在高濃度的特異性炎癥因子,如干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)反應被放大,但在炎癥因子缺乏的情況下功能被抑制[13-15]。

1.1.2 促修復機制

MSCs可釋放多種生長因子,包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、TGF-β、成纖維細胞生長因子和基質(zhì)細胞衍生因子-1[16]。這些營養(yǎng)因子促進內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和其他組織祖細胞的增殖,進而參與組織修復和再生[17]。細胞實驗[18]結果顯示:將真皮成纖維細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng),在沒有直接接觸的情況下,真皮成纖維細胞在劃痕試驗中出現(xiàn)增殖加快和遷移加速。此外,靜脈注射異體MSCs歸巢到角膜損傷部位,可明顯促進角膜熱燒傷小鼠模型角膜上皮的修復[19]。

1.1.3 抗新生血管機制

不同的微環(huán)境可調(diào)節(jié)MSC的不同行為和功能。在缺血性組織,如心肌梗死的模型[20]中,MSCs通過上調(diào)VEGF刺激梗塞組織產(chǎn)生新生血管改善心臟功能。但是在炎癥性疾病,如角膜化學傷中,MSCs則下調(diào)VEGF的表達,減少角膜新生血管的面積[21]。角膜化學傷的炎癥環(huán)境可能刺激MSCs產(chǎn)生高水平的血小板反應蛋白-1從而抑制VEGF的表達[22]。

1.1.4 細胞替代

作為多能細胞,MSCs可以分化為不同的細胞類型[23],但MSCs能否產(chǎn)生功能性角膜細胞仍然存在爭議。在特定條件下,間充質(zhì)干能分化為角膜上皮樣細胞[24]、角膜基質(zhì)樣細胞[25]和內(nèi)皮樣細胞[26]來修復受損的角膜。有研究[27]將UC-MSCs移植到小鼠角膜基質(zhì)1個月后,這些細胞呈現(xiàn)出角膜基質(zhì)樣細胞的形態(tài),并表達角膜基質(zhì)細胞標志物。但也有證據(jù)[28]表明:從MSCs衍生出來的被替換細胞并不是真正的組織細胞,MSCs可以產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)蛋白,這些蛋白有助于MSCs治療疾病,但同時也可能影響了對MSCs分化潛能的評估。

1.2 不同來源的間充質(zhì)干細胞的區(qū)別

MSCs的運用應結合MSCs的來源。雖然骨髓、臍帶血和脂肪組織來源的MSCs在形態(tài)學和表型方面無明顯差異[29],但是彼此之間的增殖和分化能力存在差異。在增殖能力方面,UC-MSCs最強,而BM-MSCs最弱;在成骨分化能力方面,UCMSCs最強,AT-MSCs最弱[30-31]。在成脂分化能力方面,BM-MSCs強于UC-MSCs[30]。在成軟骨分化能力方面,AT-MSCs強于臍帶基質(zhì)來源的[32]。此外,不同的MSCs具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能。與BM-MSCs相比,AT-MSC能更有效的抑制樹突狀細胞的形成,并且能分泌更高濃度的IL-6,IL-8,IL-12等細胞因子[33]。但是,BM-MSCs,UCMSCs,WJ-MSCs,AT-MSCs在抑制植物血凝素誘導的T細胞增殖方面沒有差異[34]。

2 間充質(zhì)干細胞在眼表疾病中的臨床前和臨床運用

截至2020年4月,在Clinical Trial上登記的干細胞研究有994項(以“mesenchymal stem cells”“mesenchymal stromal cells”“MSCs”為關鍵詞),其中與眼表相關的的僅有8項,3項與干眼相關(NCT03878628,NCT04213248,NCT00953485)、3項與角膜化學傷(NCT03237442,NCT03967275,NCT02325843)、1項與角膜緣干細胞缺乏(NCT01562002)、1項與圓錐角膜(NCT02932852)相關。而在PubMed上搜索所得的臨床相關文章亦很少,由此可見,雖然MSCs的研究如火如荼,但大多停留在基礎領域,特別是眼表方向,離臨床轉(zhuǎn)化運用依舊有一條漫長的道路。

2.1 間充質(zhì)干細胞在眼移植物抗宿主病相關性干眼及干眼中的運用

眼移植物抗宿主病(ocular graft versus host disease,oGVHD)是造血干細胞移植術后的一種常見的慢性并發(fā)癥,發(fā)病率為40%~80%[35]。T淋巴細胞通過攻擊宿主的淚腺、瞼板腺、結膜、角膜等眼表組織,產(chǎn)生與干眼、干燥綜合征、瞼板腺功能障礙相關的臨床病癥,主要表現(xiàn)為淚液分泌減少、淚膜不穩(wěn)定、結膜纖維化、瞼板腺丟失、角膜損傷等[36-37],其中干眼相關癥狀是影響oGVHD患者生活質(zhì)量的主要原因[38]。免疫細胞和細胞因子的失衡可能是oGVHD發(fā)生的原因之一[39]。MSCs在T細胞、B細胞的活化和增殖、抗炎因子和囊泡分泌等表現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)特性[40-41],使之成為治療oGVHD相關干眼的潛在選擇。Weng等[35]報道22例難治性oGVHD相關干眼患者,在經(jīng)歷了至少1個月的眼部人工淚液聯(lián)合標準的免疫抑制治療后癥狀均無明顯改善,但在給予1.0×106/kg MSCs靜脈輸注3個月后,54.55%(12/22)患者的臨床癥狀、眼表疾病指數(shù)評分和Schirmer試驗結果明顯改善,且無注射相關的不良反應。此外,患者血液中的CD8+CD28–T細胞數(shù)量增加,IL-2及IFN-γ等細胞因子的水平升高,而炎性因子IL-10和IL-4較治療前降低。另一項研究[42]也發(fā)現(xiàn)18例難治性慢性GVDH患者中的14例干眼患者,在接受1.0×106/kg MSCs靜脈輸注后的第1次評估時,有2例患者得到了眼部癥狀的緩解,在隨訪的2年時間內(nèi),有5例(35.7%)患者表現(xiàn)出臨床癥狀的改善。雖然MSCs在治療oGVHD相關性干眼方面顯示出一定的效果,但是在預防oGVHD方面效果并不理想[43]。

關于MSCs治療oGVHD相關性干眼的更多研究還處于動物實驗階段。Martínez-Carrasco等[44]在造血干細胞移植術后第10天對發(fā)生oGVHD的小鼠進行結膜下注射人MSCs(2×105/20 μL),18 d后處死小鼠。實驗組的小鼠眼部外觀正常,沒有發(fā)生眼瞼痙攣、眼瞼紅斑和眼周皮毛脫落;淚液滲透壓穩(wěn)定無升高;角膜中未發(fā)現(xiàn)免疫細胞CD3+的侵襲,且角膜上皮的角質(zhì)化程度低,此外,角膜中炎性因子的表達受到明顯抑制。這些結果表明結膜下注射MSCs能有效抑制oGVHD中的免疫反應和相關的角膜改變。另一項研究[45]通過同樣結膜下注射的方式,在移植術后15 d給予患有oGVHD的小鼠的右眼注射同樣劑量的BM-MSCs,10 d后發(fā)現(xiàn)未注射MSCs的左眼出現(xiàn)眼部外觀的改變、病理組織學見角膜萎縮、空泡化和凋亡,而注射過MSCs的右眼沒有出現(xiàn)相關改變。此外還發(fā)現(xiàn)結膜下注射的MSCs可大量遷移至角膜組織修復受損角膜,但是這一點在其他的研究中受到爭議[46]。除了結膜下注射,不同的施用途徑同樣對干眼起到良好的緩解作用。已有研究[47]對苯扎氯銨誘導的干眼模型進行BM-MSCs混懸液(1×105/25 μL)點眼,治療1周后,MSCs組的平均眼淚水量和淚膜破裂時間得分顯著增加,角膜中炎癥細胞減少,同時杯狀細胞增加。Villatoro等[48]對常規(guī)治療(皮質(zhì)類固醇、他克莫司、環(huán)孢素和人工淚液)無效的12犬只進行了眶內(nèi)腺注射脂肪來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞,隨訪3個月即可觀察到眼表癥狀的改善,并且這種改善可持續(xù)發(fā)展至隨訪的第9個月,此外,無論是Schirmer試驗亦或是其他臨床體征,均出現(xiàn)顯著好轉(zhuǎn)。Lee等[46]使用眶內(nèi)注射伴刀豆球蛋白A誘導小鼠干眼模型,并向眶周注射人源和鼠源的MSCs,結果顯示:無論是哪種來源的MSCs,均可增加淚液產(chǎn)生并抑制炎癥;此外,用MSCs治療的小鼠角膜表現(xiàn)出CD4+T細胞浸潤和促炎因子表達的抑制。雖然動物實驗表明MSCs對oGVHD相關性干眼以及其他類型的干眼的治療效果良好,但是其相關發(fā)病機制和治病機理仍不明確,限制了MSCs在臨床治療運用的轉(zhuǎn)化,因此需要進一步開展更為深入的研究。

2.2 間充質(zhì)干細胞在角膜損傷修復中的運用

多種原因會造成角膜損傷,包括化學傷、持續(xù)性角膜潰瘍、感染性角膜炎等[49],嚴重的角膜損傷常伴隨角膜緣干細胞缺乏(limbal stem cell deficiency,LSCD)、角膜混濁、角膜新生血管等影響視力的改變[50-52]。其中炎癥因子和細胞因子的持續(xù)侵入起關鍵作用,臨床上常用類固醇、免疫抑制劑、促修復等藥物治療,然而對于嚴重的病例效果并不理想[53]。間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)、促修復和抗新生血管的特性,使得它成為治療此類疾病的潛在可能。Calonge等[54]對17例角膜緣干細胞缺乏的患者實施了羊膜搭載的MSCs移植,在施行羊膜移植的過程中,沒有出現(xiàn)術中或術后并發(fā)癥,隨訪12個月,也未發(fā)現(xiàn)相關的免疫排斥反應。在6個月時,細胞移植的成功率為76.5%,12個月時為85.7%。與羊膜搭載角膜緣上皮細胞移植相比,羊膜搭載的MSCs移植能顯著恢復角膜的透明性,此外,隨著隨訪時間的增加,癥狀評分、結膜充血、角膜上皮點狀染色、角膜潰瘍均顯著好轉(zhuǎn),最佳矯正視力也從最初的0.06±0.08恢復到0.14±0.15。激光共聚焦顯微鏡檢查顯示:62.5%的病例在6個月的時候改善了角膜中央的上皮表型,第12個月時達71.4%。這首次證明MSCs可以與角膜緣干細胞一樣,安全且有效地恢復因LSCD受損的角膜。在此研究[54]中,失敗病例的原發(fā)病主要為角膜化學傷。雖然有3項注冊在案的關于MSCs在角膜化學傷中的運用的臨床研究,但是目前尚沒有明確的臨床數(shù)據(jù)。

2.3 間充質(zhì)干細胞在過敏性結膜炎中的運用

過敏性結膜炎是眼科門診最常見的疾病之一,典型癥狀包括眼癢、異物感、分泌物增加等,因其常反復發(fā)作,過敏性結膜炎可顯著影響患者的健康和生活質(zhì)量[55-58]。近年來,越來越多的研究關注了MSCs與過敏性疾病的關系。研究發(fā)現(xiàn):使用MSCs能夠減弱過敏性疾病的癥狀[59],包括哮喘[60]、變應性鼻炎[57]、過敏性皮膚病[61]等。然而,MSCs治療過敏性結膜炎的研究鮮少報道,PubMed上僅有一項關于動物實驗的研究[62]。Su等[62]發(fā)現(xiàn)局部滴用TNF-α刺激的MSCs的培養(yǎng)液可較大程度地減輕豚草花粉誘導的小鼠過敏性結膜炎的臨床癥狀,該培養(yǎng)液可能通過降低炎癥細胞的數(shù)量和相關的分子水平、抑制IgE和組胺分泌,起到良好的抗過敏效果。雖然現(xiàn)在臨床常用的肥大細胞膜穩(wěn)定劑、抗組胺藥物和皮質(zhì)類固醇對過敏性結膜炎具有良好的控制效果,但是并不能控制過敏性結膜炎的反復發(fā)作,且存在長期滴用眼部不適,而MSCs可與免疫細胞相互作用,從而誘發(fā)免疫耐受,這可能可以發(fā)揮更長時間的抗過敏療效。因此更多關于MSCs和過敏性結膜炎的長期療效值得被關注。

2.4 間充質(zhì)干細胞在角膜移植中的運用

角膜移植是拯救角膜疾患導致的失明最有效的方法,在全球范圍內(nèi),每年進行的角膜移植超過18萬次[63]。然而,多種因素,如原發(fā)病導致的新生淋巴管、血管、炎癥等,會導致角膜移植排斥[64-66]。與其他器官排斥類似,角膜移植排斥亦是一個免疫異常的過程[67]。因此,間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)特性使其有望成為治療此類疾病的方式。雖然暫時還沒有注冊和發(fā)表的臨床研究,但是已有多項臨床前研究對其治療效果進行了探討。與其他眼表疾病不同,角膜移植術前使用MSCs治療效果更好。在其他器官移植的實驗中,術前輸注可延長移植器官的存活時間,這可能由于預輸注的同種異體來源的MSCs激活了宿主的免疫反應,進而產(chǎn)生了免疫耐受使得后續(xù)移植物被接受[68-69]。Oh等[70]發(fā)現(xiàn):術前1 d增加MSCs靜脈注射比僅在術后進行MSCs靜脈注射擁有更高的移植物存活率,并進一步降低了角膜中樹突狀細胞、巨噬細胞和CD3+T細胞的數(shù)量,表現(xiàn)出更好的抗炎效果。Ko等[71]的研究結果也顯示:術前靜脈注射MSCs可以顯著延長角膜移植物的存活時間,顯著降低促炎因子IFN-γ和IL-2的表達水平顯著。然而Jia等[72]通過對比移植前連續(xù)3 d和移植后連續(xù)3 d給予大鼠靜脈輸注BM-MSCs后發(fā)現(xiàn):術前輸注的效果與不使用MSCs的效果相似,而術后輸注的效果可以明顯延長移植物的存活時間。在角膜移植排斥的實驗中,MSCs注射的時機存在爭議。盡管如此,大部分研究[73-74]仍顯示出MSCs在角膜移植排斥中延長移植物存活的作用。

3 間充質(zhì)干細胞在眼表運用的困難、局限及未來方向

間充質(zhì)干細胞由于其免疫調(diào)節(jié)、組織修復、抗新生血管等特性,在各種難治性疾病的治療中一直被寄予很大的期待。大部分現(xiàn)有的臨床前研究證明了其積極的治療效果,但是運用MSCs治療仍然存在挑戰(zhàn)。首先,MSCs從臨床前研究到臨床試驗的轉(zhuǎn)化能力有待認證。目前MSCs治療的安全性和有效性大多基于動物的臨床前研究和體外的細胞分子實驗,然而人與動物MSCs的免疫相容性、劑量、適應性和效力可能有所不同[75],在眼表所進行的臨床研究也表現(xiàn)出不及動物研究的有效性,MSCs從臨床前動物研究的有效結果到臨床試驗的等效性尚有爭議。其次,由于MSCs來源不同且各研究間分離、分選、離體擴增、純化的方法各異,這可能造成實驗結果重復性不足,引起MSCs的療效評估困難,MSCs臨床轉(zhuǎn)化與運用更加復雜。此外,雖然MSCs在某些疾病的治療研究中已取得良好的效果,但是其作用機制尚未完全明朗,在不同的疾病中,細胞間接觸與分泌的可溶性因子有所不同,而且MSCs易受到周圍微環(huán)境的影響而分泌不同的細胞因子,因此貿(mào)然進行人體試驗可能會帶來潛在的風險。但不可否認的是,現(xiàn)有的結果依舊表明MSCs是治療眼表疾病非常有前途的工具。因此,更多涉及標準化MSCs以便于臨床使用以及不同研究者進行療效比較的研究值得期待。

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