胡夢弦 何貴新 秦偉彬 吳成強 林 琳 王明遠 馮雨菲 鄭國坤

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530299，電子郵箱：2836923992@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管二區(qū)，南寧市 530023)

【提要】 缺血再灌注損傷作為影響冠狀動脈介入術預后的常見影響因素，其嚴重程度與心臟功能的恢復息息相關，但目前對于該損傷尚無特別的防治手段。外泌體的出現(xiàn)，揭開了其新的治療領域。外泌體由多種細胞分泌，廣泛存在于各種組織細胞和體液中，對機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，能夠通過調(diào)控各種因子改善受損的心肌細胞，對恢復心臟功能具有重要的作用。本文通過外泌體對心肌組織缺血再灌注損傷后心肌細胞的修復、巨噬細胞表型的調(diào)控、心肌纖維化及新生血管的增生等方面的影響進行綜述，望為心肌組織缺血再灌注損傷的治療干預提供新的思維方向。

冠狀動脈狹窄或栓塞是心肌組織缺血的主要原因之一，長期缺血將導致心肌細胞不同程度的功能代謝紊亂、損傷甚至死亡。經(jīng)皮冠狀動脈介入術是目前治療冠心病的有效方式，其通過植入導管、球囊、支架等方式使狹窄或栓塞的血管再度通暢，恢復血流對心肌細胞的營養(yǎng)供給。但在恢復血供的同時可能會導致已受損的心肌細胞出現(xiàn)缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)，擴大心臟損傷的范圍，加重心肌重塑，或?qū)е滦牧λソ叩漠a(chǎn)生。如何規(guī)避或降低該損傷對提高手術療效具有重要的意義。外泌體是一種可由多種細胞分泌的囊泡小體，其在機體內(nèi)分布廣泛，可操作性強，能夠通過減輕心肌細胞炎癥反應、抑制心肌纖維化、促進心肌細胞的修復及新生血管的生成等方面減輕IRI。故本文針對外泌體對心肌IRI的干預機制研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體簡介 外泌體是一類由多種細胞分泌的，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA及各種RNA[例如mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA) 和環(huán)狀RNA]的囊泡小體，直徑為30～150nm。目前公認的外泌體形成模式是：由細胞膜內(nèi)陷形成多囊泡體，多囊泡體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞質(zhì)膜融合形成一種管腔內(nèi)囊泡從而釋放出胞外形成外泌體。研究表明，外泌體在機體的細胞分化、免疫應答、抗原呈遞等生命代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。其作用方式可能包括：(1)外泌體直接作用于靶細胞膜表面信號分子進行信息傳遞交流[1]；(2)外泌體通過釋放信號分子作用于靶細胞膜表面的信號受體，從而進行細胞間的信號傳遞[2]；(3)外泌體囊泡膜與靶細胞細胞膜識別融合后，通過外泌體內(nèi)容物的轉(zhuǎn)輸進行信息的轉(zhuǎn)運[3]。

1.2 外泌體提取方式 根據(jù)外泌體的體積、密度及表面特征性標志物，目前提取的方法可分為：(1)超速離心法，其根據(jù)外泌體的體積及密度在離心力作用、磷酸鹽緩沖液沖洗等流程后收集，適用于體積較大外泌體的收集，其工藝成熟，是目前外泌體收集的常用方法。(2)密度梯度離心法，是一種較超速離心法更為嚴格、純度更高的一種提取方式，通常將待分離溶液滴入至不同溶度梯度的蔗糖等小分子溶劑中，不同密度物質(zhì)間存在沉降系數(shù)差，在離心力的作用下各物質(zhì)以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶[4]。(3)超濾法，是一種根據(jù)外泌體體積進行分離的方法，其原理是利用半透膜的微孔結(jié)構(gòu)，在一定外界推動力的作用下將外泌體選擇性回收；該方法的缺點是較大的囊泡和蛋白質(zhì)被濾膜吸附，可能導致濾孔堵塞，影響外泌體的收集[5]。(4)免疫磁珠法，是運用核—殼的合成方法合成內(nèi)含超順磁性物質(zhì)、外裹特異性表面標記物的高分子免疫磁珠，這些免疫磁珠能結(jié)合相應的外泌體，在外加磁場的吸引下可做定向移動。

2 心肌細胞IRI的機制

IRI的發(fā)生涉及多種復雜的機制。目前，已知的機制包括：(1)氧化自由基增多。缺血心肌區(qū)域內(nèi)的氧化自由基顯著增多，其能攻擊細胞及細胞內(nèi)各種生物膜成分中的不飽和脂肪酸，破壞膜的完整及通透性、提高生物膜流動性，導致細胞水腫，細胞質(zhì)疏松及細胞順應性降低。(2)線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。線粒體功能正常是減少IRI的關鍵因素。當心肌細胞發(fā)生再灌注損傷后，細胞內(nèi)能量失衡，心肌細胞氧化應激和(或)三磷酸腺苷耗盡，隨后線粒體鈣負荷達到病理高水平，誘導線粒體內(nèi)膜滲透率過渡孔開放，各種因子流入線粒體內(nèi)，使得線粒體腫脹進而導致三磷酸腺苷的產(chǎn)生減少，細胞迅速死亡[6]。另一方面，來源于線粒體的超氧化物陰離子大量產(chǎn)生，負調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的抗氧化物，從而導致細胞損傷加重[7]。(3)鈣離子超載。Ca2+作為維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的第二信使，在IRI發(fā)生時，由于心肌細胞膜上的Ca2+通道相關酶的活性降低，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活磷脂酶進而溶解細胞內(nèi)的生物膜，最終使得心肌細胞損傷或凋亡[8]。(4)炎癥反應。缺血再灌注誘導的炎癥在心肌細胞損傷和心功能障礙中起重要作用[9]。心肌缺血再灌注能誘導核因子κB信號通路的激活以及淋巴細胞分泌的細胞因子表達。而細胞因子可直接誘導心肌細胞凋亡，淋巴細胞可進一步加重心臟損傷。

3 外泌體對心肌IRI的影響

3.1 外泌體對巨噬細胞的作用 當發(fā)生IRI時，心肌細胞啟動凋亡程序，外周血管中的單核細胞逐漸向炎癥區(qū)域募集，在各種促分化因子的作用下，分別轉(zhuǎn)化成M1、M2型巨噬細胞，發(fā)揮促炎或抗炎等作用。研究表明，在急性心肌梗死出現(xiàn)后的3 d內(nèi)，M1型巨噬細胞大量增加，在第3天達到高峰，且白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-8等細胞因子水平增高；在3 d后，M2型巨噬細胞數(shù)量逐漸增加，在5～7 d時，M1型巨噬細胞逐漸被M2型巨噬細胞所代替，且促進愈合因子水平增高，如成纖維生長因子及細胞因子IL-10等[10]。此外，在心肌損傷的同時，血液循環(huán)中的單核細胞被招募至受損心肌組織，取代原有的M2型巨噬細胞，然后分化為具有診斷性意義的M1型巨噬細胞，加重心肌損傷[11-12]。在心肌損傷的修復過程中，調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞的水平確實能夠減輕心肌組織的損傷范圍，但不意味著要完全抑制M1型巨噬細胞的表達。Jia等[13]發(fā)現(xiàn)，完全抑制心肌組織中M1型巨噬細胞的表達并不能有效減輕心肌細胞的纖維化，而通過增加M2型巨噬細胞的數(shù)量，并減少M1型巨噬細胞數(shù)量，才能夠有效減輕小鼠心肌纖維化程度。因此，促進M2型巨噬細胞的產(chǎn)生對減輕心肌纖維化水平、降低IRI的嚴重程度具有重要的意義。外泌體作為一類由多種細胞分泌的囊泡物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，減輕炎癥反應。有學者將來源于人臍帶間充質(zhì)干細胞的外泌體與單核巨噬細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠有效促進單核巨噬細胞的增長，在一定水平上抑制M1型巨噬細胞的表達，并促進單核巨噬細胞向M2型巨噬細胞的轉(zhuǎn)化，同時可提高IL-10的表達水平，而降低炎性因子IL-8、IL-12的分泌水平，且這種作用效果與外泌體的溶度呈正比[14]。這對減輕心肌細胞炎癥、緩解IRI具有重要作用。

3.2 外泌體對心肌纖維化的抑制作用 當炎癥因子被抑制后，促纖維化信號增強，心肌組織進入纖維增殖期。成纖維細胞和肌成纖維細胞在心肌纖維化的形成中發(fā)揮著主要作用，正常的心肌組織中不存在肌成纖維細胞，當心肌纖維化開始時，成纖維細胞在信號因子的作用下大量增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。心臟組織的纖維增殖期可分為兩大過程，即修復性纖維化(梗死區(qū)心肌重塑)和反應性纖維化(非梗死區(qū)心室壁重塑)。修復性心肌纖維化對于維持心室的功能、保護心臟的完整性至關重要，但過度的心肌纖維化將引起心室收縮力進行性下降，甚至導致心力衰竭的發(fā)生。因此，控制肌成纖維細胞水平對減少心肌瘢痕組織至關重要。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是多效性細胞因子，對肌成纖維細胞的形成具有促進作用，研究表明,外泌體源性miRNA-425和miRNA-744能夠抑制TGF-β受體蛋白的表達而減少肌纖維的表達，從而抑制心肌纖維化[15-16]。方碩[17]通過對臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的蛋白質(zhì)和核酸進行裂解，發(fā)現(xiàn)外泌體的核酸成分是抑制心肌細胞纖維化的主要物質(zhì)，且核酸的主要成分是miRNA；在進一步的實驗中，其發(fā)現(xiàn)miRNA-23a和miRNA-125b通過抑制TGF-β/Smad通路來減少肌成纖維細胞的形成。研究顯示，miRNA-133a通過調(diào)節(jié)TGF-β1和CTGF的表達水平來抑制心肌纖維化，而轉(zhuǎn)染miRNA-133a的心房組織TGF-β1和CTGF的表達水平下降，而敲除miRNA-133a的成纖維細胞和心肌細胞中CTGF的表達水平上升，心肌纖維化水平也隨之改變[18-19]。由此可見，外泌體或通過miRNA抑制心肌細胞纖維化，從而減輕IRI的嚴重程度。

3.3 外泌體對受損心肌的修復作用 冠狀動脈狹窄導致心肌細胞長期處于缺血狀態(tài)，當支架植入后心肌組織恢復血供將會使心肌細胞發(fā)生IRI，如何將IRI降至最低是減少經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后遺癥的關鍵，而外泌體作為修復受損心肌的“治療劑”發(fā)揮著至關重要的作用。產(chǎn)進中等[20]發(fā)現(xiàn)，對大鼠心臟進行缺血預處理后，其血清外泌體含量明顯高于未經(jīng)缺血預處理的大鼠，此外在IRI發(fā)生前將外泌體注入模型鼠靜脈內(nèi)可使得心肌梗死面積顯著減少。心肌球源性干細胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 是一類可以促進心肌細胞再生的心肌來源球細胞，研究表明，CDC分泌的外泌體可以復制CDC的心臟保護和再生作用[21]，能夠有效地抑制心肌細胞的凋亡[22]。 Gallet等[23]發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死和慢性心肌梗死的豬模型中，將來源于CDC的外泌體注射到梗死的心肌內(nèi)可明顯減輕IRI，提高左心室射血分數(shù)，并抑制心臟不良重塑。Xiao等[24]對心臟祖細胞進行氧化應激處理后發(fā)現(xiàn)，與正常細胞相比，心臟祖細胞能夠分泌更多的外泌體，并且外泌體中miRNA-21表達水平顯著提高，能夠通過恢復miRNA-21/程序性細胞死亡-4通路阻止心肌細胞發(fā)生氧化應激相關性凋亡。

3.4 外泌體對新生微血管形成的促進作用 促進新生微血管的形成是外泌體的一項重要功能，其包括促進微血管的生成和增殖。這些作用與外泌體的分化、遷移以及原有存在于血管中的外泌體有關。 Arslan等[25]發(fā)現(xiàn)，來自間充質(zhì)干細胞的外泌體可以通過激活促生長因子信號，一定程度上恢復受損細胞的生物活性，并且減輕氧化應激反應，從而提高心肌活力，抑制心肌IRI后的不良重構(gòu)。同樣有研究顯示，由間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體在微血管內(nèi)內(nèi)化后，對血管的生成及增殖和心肌細胞的修復發(fā)揮重要的作用[26]。研究表明，將來自間充質(zhì)干細胞的外泌體注射到卒中大鼠體內(nèi)，可以通過促進血管生成、神經(jīng)突重塑和神經(jīng)細胞新生來緩解癥狀[27]。此外，在缺氧條件下來源于臍帶間充質(zhì)干細胞的外泌體不僅能夠促進臍帶血管內(nèi)皮細胞的增生和毛細血管的生成，還豐富了臍帶毛細血管網(wǎng)，使得血流得以恢復[28]。還有研究表明，心臟祖細胞釋放的外泌體可通過促進內(nèi)皮細胞遷移和血管內(nèi)皮生長因子的分泌，誘導心肌組織和血管的再生，從而顯著改善心臟功能[29-30]。

4 小結(jié)與展望

心肌IRI是心梗后不可避免的病理過程，可造成心肌組織微循環(huán)障礙和細胞氧化應激損傷。外泌體作為由多種細胞分泌的囊泡小體，攜帶各種生物信號分子，其利用表面特異性膜蛋白與特定靶細胞結(jié)合，完成細胞間生物信號的特異性傳遞。目前大量研究表明外泌體能夠通過抑制炎癥反應減少心肌細胞受損，調(diào)節(jié)心肌纖維化、減低心臟瘢痕面積和促進新生血管的形成以改善心臟微循環(huán)。因此，以外泌體為研究靶點更深入地研究心肌IRI對心肌梗死患者的預后具有重要的意義。