石禹，包小峰，陸群，喬進(jìn)，劉凌燕

(1.南通大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，南通 226006；2.南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001；3.南開大學(xué)元素有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

衣原體是一類嚴(yán)格在真核細(xì)胞內(nèi)專性寄生生活的革蘭陰性病原體，它在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖呈現(xiàn)兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱為原體(elementary body，EB)和網(wǎng)狀體(reticular body，RB)，衣原體具有從EB到RB再到EB獨(dú)特的發(fā)育周期[1]。目前臨床上衣原體感染的治療主要依靠包括四環(huán)素類(如多西環(huán)素)、大環(huán)內(nèi)酯類(如阿奇霉素)等抗菌藥物[1]，雖然在大多情況下抗感染治療有效，但是耐藥現(xiàn)象同樣屢見不鮮，并且臨床上衣原體持續(xù)隱蔽感染和復(fù)發(fā)的病例日益增多[2-3]。目前，仍沒有可以投入臨床使用的新型抗衣原體藥物[4]，本文主要研究合成的二氫苯并呋喃醇衍生物的抗衣原體活性，分析其抗衣原體作用的機(jī)制，為尋找更好的抗衣原體化合物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、衣原體及化合物 細(xì)胞：人宮頸癌細(xì)胞HeLa S3、人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2。衣原體：沙眼衣原體L2(CtL2)，接種于HeLa S3細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)，肺炎衣原體AR39(CpnAR39)，接種于Hep-2細(xì)胞35 ℃培養(yǎng)?；衔铮?個前期合成的二氫苯并呋喃醇類化合物由南開大學(xué)柳凌艷老師提供[5]，簡稱為1-5，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，固體粉末溶于二甲亞砜(DMSO)配制成100 mmol·L-1儲存液，-20 ℃避光保存；實(shí)驗(yàn)時用完全培養(yǎng)基稀釋至需要的濃度。

圖1 化合物1-5的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2藥品與主要試劑 DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司(AC11018291)；胎牛血清購自美國Sigma公司(17D178)；PBS購自美國Hyclone公司(AF29485473)；細(xì)胞染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自武漢博士德生物工程有限公司(130307)；疊氮鈉購自青島雪潔助劑有限公司(404C051)；Na2HPO4、KH2PO4購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司(20130205)。四環(huán)素購自生工生物上海有限公司(200-593-8)潔助劑有限公司(404C051)本實(shí)驗(yàn)室自制的小鼠來源的抗鼠衣原體MoPn(C.muridarum strain Nigg II)抗血清用于檢測CtL2[6]，自制的小鼠來源的抗CpnAR39抗血清用于檢測CpnAR39[7](KHP2016073)，F(xiàn)ITC親和標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗夠自美國Sigma公司(SLBX2002)。

1.3免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 將HeLa S3細(xì)胞接種于放置了蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)過夜。按每孔感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)0.2分別加入CtL2，并在感染的同時分別加入0.5，1，2，4，8，16 μmol·L-1的化合物，0.1% DMSO為陰性對照，11.25 μmol·L-1四環(huán)素為陽性對照[8]。在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，甲醇固定細(xì)胞，依次使用對應(yīng)的檢測抗體和FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色，同時使用伊文思藍(lán)(Evans Blue)染色細(xì)胞質(zhì)，通過Olympus IX51熒光顯微鏡采用20×物鏡拍攝圖片。

1.4感染性子代滴度測定實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種到48孔板中，培養(yǎng)過夜后按上述方法感染衣原體并加入化合物。對于CpnAR39，需室溫900×g離心1 h以促進(jìn)其感染。在37 ℃(CtL2)或35 ℃(CpnAR39)培養(yǎng)36 h后，刮取細(xì)胞，并超聲裂解釋放子代衣原體。將裂解液按1：10連續(xù)稀釋后，再次感染96孔板中的細(xì)胞，36 h后同上方法進(jìn)行免疫熒光染色，顯微鏡下計數(shù)包涵體的數(shù)量，并由此計算出每個樣品中的感染性子代的滴度值。最后，將各實(shí)驗(yàn)組的滴度值按(陰性對照組-實(shí)驗(yàn)組)/ 陰性對照組×100% 得到各實(shí)驗(yàn)組的抑制率，采用非線性回歸計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值，并以平均值(95%置信區(qū)間)表示。

1.5細(xì)胞毒性測定實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞種于48孔板中，分別給予16 μmol·L-1化合物處理，對照組為0.1% DMSO。48 h后甲醇固定，Evans Blue染細(xì)胞形態(tài)(紅色)，DAPI染細(xì)胞核(藍(lán)色)?；蛘邔⑸鲜龌衔锾幚淼募?xì)胞在48 h后用胰酶消化，計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.6宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 將16 μmol·L-1化合物與48孔板中的宿主細(xì)胞在37 ℃預(yù)孵育2 h，洗去化合物后按MOI 0.2加入CtL2感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后進(jìn)行免疫熒光染色，計數(shù)包涵體數(shù)量，包涵體的數(shù)量即反映感染進(jìn)入細(xì)胞的衣原體數(shù)量。

1.7衣原體預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 將16 μmol·L-1化合物與CtL2 在4 ℃預(yù)孵育1 h，洗去化合物后按MOI 0.2加入CtL2感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后進(jìn)行免疫熒光染色，計數(shù)包涵體數(shù)量，包涵體的數(shù)量即反映感染進(jìn)入細(xì)胞的衣原體數(shù)量。

1.8后加藥實(shí)驗(yàn) 以MOI 0.2的CtL2感染過夜培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，而后分別在感染后0(即感染同時加入化合物，陽性組)2，12和24 h加入16 μmol·L-1化合物，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h收獲細(xì)胞，測定感染性子代的滴度值。以感染但不給予化合物處理作對照組，將各組滴度值按(對照組-實(shí)驗(yàn)組)/對照組×100% 計算各實(shí)驗(yàn)組的抑制率。

1.9撤藥實(shí)驗(yàn) 以MOI 0.2的CtL2感染過夜培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，感染的同時即加入16 μmol·L-1化合物，而后分別在感染后2，12，24和36 h(即感染全程化合物處理，陽性組)洗去化合物，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h收獲細(xì)胞，測定感染性子代的滴度值。以感染但不給予化合物處理作對照組，將各組滴度值按(對照組-實(shí)驗(yàn)組)/對照組×100% 計算各實(shí)驗(yàn)組的抑制率。

2 結(jié)果

2.1化合物對CtL2生長有抑制作用 免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖2)，隨著化合物處理濃度的增加，包涵體數(shù)量逐漸減少、大小也逐漸減小，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系。感染性子代滴度測定結(jié)果顯示(圖3)，化合物1—5對CtL2感染性子代也呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制效果，該作用與免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的直接抑制效果一致，由此得出二氫苯并呋喃醇類化合物1—5可以抑制CtL2的生長?；衔飳tL2感染性子代滴度的IC50值見表1，為4～6 μmol·L-1。

2.2化合物對CpnAR39生長也有抑制作用 感染性子代滴度測定結(jié)果顯示見圖4，化合物對CpnAR39感染性子代也都呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制效果，其IC50值為4～8 μmol·L-1。結(jié)合CtL2結(jié)果可以得出二氫苯并呋喃醇類化合物1—5對衣原體的生長抑制作用具有廣譜性。對比表1中5個化合物的IC50值發(fā)現(xiàn)，它們對CtL2 的抑制作用略強(qiáng)于CpnAR39。基于此，后面的機(jī)制探索將以CtL2為研究對象。

2.3化合物的抗衣原體活性與細(xì)胞毒性無關(guān) Evans Blue和DAPI染色結(jié)果顯示(圖5A)，與對照組相比，化合物處理48 h后的宿主細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核均沒有發(fā)生改變，表明在16 μmol·L-1(抗衣原體活性檢測中的最高濃度)時化合物處理不存在明顯的細(xì)胞毒性作用?；罴?xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果(圖5B)，與DMSO組相比化合物處理沒有改變細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步證明5個二氫苯并呋喃醇類化合物對宿主細(xì)胞沒有毒性作用。

2.4化合物對衣原體感染過程的影響 宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn)顯示(圖6A)，化合物處理組的包涵體數(shù)量與對照組(0.1% DMSO)相比沒有統(tǒng)計學(xué)差別，說明宿主細(xì)胞的化合物預(yù)處理不會影響衣原體感染進(jìn)入細(xì)胞。衣原體預(yù)處理實(shí)驗(yàn)顯示(圖6B)，化合物處理組的包涵體數(shù)量與對照組相比也沒有統(tǒng)計學(xué)差別，說明衣原體的化合物預(yù)處理也不會影響衣原體感染進(jìn)入細(xì)胞。綜上所述，本研究中的5個二氫苯并呋喃醇類化合物不影響衣原體的感染過程。

2.5化合物對衣原體增殖過程的影響 后加藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7A)，對化合物1，3，5來說，與陽性組相比，在感染2或12 h后加入對它們的抑制效果影響不大，只有在感染24 h后加入才會顯著降低它們的抑制作用，說明化合物1，3，5對衣原體的生長抑制主要作用于12 h以后的階段，即RB增殖和RB向EB轉(zhuǎn)化階段；對化合物2，4來說，與陽性組相比，在感染2 h后加入化合物就開始對它們的抑制效果產(chǎn)生影響，晚于12 h再加入化合物會極大影響它們的抑制能力，說明加入化合物時間越早則抑制效果越強(qiáng)，化合物2，4對衣原體的生長抑制需要全程的持續(xù)作用。

撤藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7B)，對所有化合物來說，與陽性組相比，在感染后2 h撤去化合物它們的抑制作用幾乎消失，說明它們的抑制作用不在感染后的0～2 h即EB進(jìn)入宿主細(xì)胞的階段，而在EB進(jìn)入宿主細(xì)胞之后的階段；對化合物1，3，5來說，與陽性組相比，在感染后12 h撤去化合物對它們的抑制作用影響不大，說明化合物1，3，5對衣原體生長的2～12 h即EB向RB轉(zhuǎn)化過程有很強(qiáng)的抑制作用；對化合物2，4來說，與陽性組相比，在感染后12 h撤去化合物對它們的抑制仍然影響很大，只有在感染24 h后撤去化合物才不會對它們的抑制作用產(chǎn)生影響，說明化合物撤去的越晚對它們的抑制作用影響越小，也進(jìn)一步表明化合物2，4對衣原體的生長抑制需要全程的持續(xù)作用。

3 討論

抗菌藥物一直是臨床上治療衣原體感染的首選藥物[9]，然而抗菌藥物耐藥、持續(xù)感染和復(fù)發(fā)等現(xiàn)象對抗菌藥物治療衣原體感染帶來了挑戰(zhàn)。在缺少有效抗衣原體疫苗的情況下，尋找新的抗衣原體化合物可能是一個解決問題的有效途徑[9]。

本研究以前期合成的5個二氫苯并呋喃醇類化合物為對象，報道了該類化合物的體外抗衣原體活性。5個化合物的抗衣原體活性具有廣譜性，對可導(dǎo)致性病淋巴肉芽腫的CtL2(圖1)和可引起肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的CpnAR39(圖4)這兩個人源病原株都具有較好的抑制作用。另外它們對鼠衣原體MoPn也具有抑制作用，只是活性相對要弱一些，IC50值都在10 mmol·L-1以上。

圖2 免疫熒光染色代表圖

圖3 化合物對CtL2感染性子代滴度抑制率

表1 化合物1—5抑制CtL2和Cpn AR39的IC50值

圖4 化合物對Cpn AR39感染性子代滴度抑制率

衣原體是嚴(yán)格的宿主細(xì)胞內(nèi)寄生病原菌，宿主細(xì)胞的生長狀態(tài)也會影響衣原體的生長，為此本研究評估了化合物對宿主細(xì)胞的毒性作用。Evans Blue細(xì)胞形態(tài)染色、DAPI細(xì)胞核染色和活細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)表明(圖5)，本研究中的5個二氫苯并呋喃醇類化合物對宿主細(xì)胞沒有毒性作用，這些結(jié)果證明了其抗衣原體活性與其宿主細(xì)胞毒性作用無關(guān)。

A.熒光染色代表圖，Evans Blue(紅色)，DAPI(藍(lán)色)；B.活細(xì)胞數(shù)量。

A.宿主細(xì)胞預(yù)處理實(shí)驗(yàn)；B.衣原體EBs預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。

衣原體的生長發(fā)育具有獨(dú)特的EB和RB兩相發(fā)育周期，因此其生長發(fā)育過程可分為感染和增殖兩個階段。在感染階段，EB與宿主細(xì)胞接觸粘附后通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[1]，本研究發(fā)現(xiàn)，將宿主細(xì)胞或EB分別與化合物預(yù)孵育均不能影響EB感染進(jìn)入細(xì)胞(圖6)，這些結(jié)果說明5個二氫苯并呋喃醇類化合物的抗衣原體作用不涉及衣原體的感染過程。對于CtL2來說，一般情況下感染宿主細(xì)胞后的0～2 h主要是EB粘附、進(jìn)入細(xì)胞的過程，2～12 h主要是EB→RB的轉(zhuǎn)化過程，12～24 h主要是RB→RB的復(fù)制(即RB增殖)過程，24～36 h主要是RB→EB的轉(zhuǎn)化過程[1]，為此，筆者設(shè)計了后加藥和撤藥實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析了化合物對衣原體不同發(fā)育階段的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在衣原體感染宿主細(xì)胞2 h后就去除化合物，這5個化合物的抗衣原體作用幾乎消失(圖7B)，說明僅有0～2 h的化合物作用不能抑制衣原體生長，表明5個二氫苯并呋喃醇類化合物對衣原體感染進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程沒有影響，這一結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了宿主細(xì)胞或EB預(yù)處理的結(jié)果(圖6)。對于化合物1，3，5在感染后12 h再加入對它們的抑制效果影響不大(圖7A)，如果改成感染時即加入而后在12 h撤去同樣對它們的抑制效果影響不大(圖5B)，這些結(jié)果表明化合物1，3，5對衣原體的增殖全過程都具有很強(qiáng)的抑制作用，可以抑制EB→RB的轉(zhuǎn)化過程、RB→RB的增殖過程和RB→EB的轉(zhuǎn)化過程。對于化合物2，4來說，在感染后2 h加入就會削弱它們的抗衣原體效果，晚于12 h則影響極大(圖7A)，如果改成感染時即加入化合物則早于24 h撤去同樣對其抑制效果影響很大(圖7B)，這些結(jié)果表明化合物2，4對衣原體增殖的過程抑制作用較弱，并且需要全程的持續(xù)作用，作用的時間越長效果越強(qiáng)。

A.后加藥實(shí)驗(yàn)；B.撤藥實(shí)驗(yàn)。

四環(huán)素類(主要是多西環(huán)素)作為衣原體感染的臨床首選藥物，四環(huán)素抑制CtL2的IC50值約為20 nmol·L-1[7]，而二氫苯并呋喃醇類化合物的IC50值約為5 mmol·L-1，活性差距較大。盡管如此，本研究報道了二氫苯并呋喃醇類化合物的抗衣原體活性，可作為先導(dǎo)化合物為今后研究其衍生物的抗衣原體活性奠定基礎(chǔ)，將有助于推動新型抗衣原體藥物開發(fā)的進(jìn)程[10]。