郭愛鑫，鞏孝芳，何佳璘，郭一鳴，寧麗峰，陳曉鋒，徐娟，郭穎志，王慧萍，

(1.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所，北京 100081)

據(jù)統(tǒng)計，每年通過臨床試驗申請上市的藥物中，約57%的藥物因溶解度和生物利用度低在上市不久即被淘汰。溶解性和生物利用度問題成為嚴重制約藥物研發(fā)和應用的瓶頸[1]。藥物共晶因為可以有效改善藥物理化性質(zhì)、提高藥物的治療效果而成為新的研究熱點。

雌二醇(estradiol，E2)分子式為C18H24O2，化學名：雌甾-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇，是最主要也是活性最強的雌性激素。在臨床上主要用于避孕、激素代替療法以及更年期和絕經(jīng)后癥狀[2-9]。雌二醇在生物藥劑學分類系統(tǒng)屬于Ⅱ類[10]，在水中的溶解度為0.2～5 g·mL-1[11]，并且溶出較慢，相應的生物利用度很低(在人體的生物利用度大概是為10%)。所以，采用切實可行的方法提高其溶解性，是提高雌二醇生物利用度常用策略。

本研究利用多種方法篩選雌二醇共晶，并進行評估，以獲得優(yōu)勢共晶，改善雌二醇的生物利用度，增進藥物臨床療效。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑 藥物活性成分(API)：雌二醇(華潤紫竹，批號：20160712，含量：99.90%)。溶劑：異丙醇(麥克林，批號：c10475860，含量：99.5%)；乙腈(麥克林，批號：c10392267，含量：99.0%)；正丁醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150914，含量：99.5%)；正丙醇(西隴化工股份有限公司，批號：1301021，含量：99.0%)；乙酸乙酯(北京化工廠，批號：20160309，含量：99.5%)；正己烷(北京化工廠，批號：20170612，含量：95%)；三氯甲烷(北京化工廠，批號：20150202，含量：99.0%)；環(huán)己烷(麥克林，批號：10511344，含量：99.5%)；二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150930，含量：99.0%)；二甲亞砜(天津福晨化學試劑廠，批號：20150907，含量：99.1%)；四氫呋喃(北京化工廠，批號：20190215，含量：99.8%)；二氧六環(huán)(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160902，含量：99.5%)；無水乙醇(北京化工廠，批號：20160612，含量：99.7%)；甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司，批號：p1460625，含量：99.9%)；石油醚(北京化工廠，批號：20170316，含量：99.7%)；丙酮(北京化工廠，批號：20151102，含量：99.5%)；95%乙醇(北京東方事博精細化工有限公司，批號：20170116，含量：95.0%)；二氯甲烷(北京化工廠，批號：20150407，含量：99.5%)；吡啶(北京化工廠，批號：20091203，含量：99.5%)；苯(北京化工廠，批號：20140909，含量：99.5%)。

共晶形成物 (cocrystal formation，CCF)：尿素(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171108，含量：99.0%)；乙酰胺(天津大茂化學試劑廠，批號：20170801，含量：98.5%)。

1.2主要實驗儀器 Smart Apex Ⅱ型X-射線單晶衍射儀(美國Bruker公司)；D/max-2250型粉末X射線衍射分析儀(日本Rigaku公司)；TGA/DSC-1型熱重分析儀(瑞士Mettler Toledo公司)；DSC-1 500型差示掃描量熱分析儀(瑞士Mettler Toledo公司)；紅外光譜儀(美國Perkin Elmer 公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；RC806D型溶出儀(天津大學)；Delta320型pH計(瑞典梅特勒公司)；MS-H-Pro LCD型綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱(上海菁海儀器有限公司)；MS-H-Pro LCD型紫外-可見分光光度計(上海元析)；FA2104N型電子天平(上海菁海儀器有限公司，感量：0.1 mg)。

1.3實驗方法

1.3.1溶解性試驗 稱取樣品定容于(25±2) ℃溶劑，間隔5 min劇烈振搖30 s；觀察30 min內(nèi)樣品的溶解情況。

1.3.2制備方法 ①研磨法：按摩爾比1：1的比例將API和CCF加入球磨罐(研缽)中，加入一定量溶劑，研磨一定時間。②混懸法：按摩爾比1：1的比例將API和CCF投料，加入溶劑和攪拌子，攪拌一定時間，取少量樣品置于濾紙上干燥，PXRD檢測晶相。③蒸發(fā)結(jié)晶法：按摩爾比1：1的比例把API和CCF(配體)溶解在溶劑中，通過溶劑的緩慢蒸發(fā)而獲得共晶。④降溫析晶法：按摩爾比1：1的比例把API和CCF溶解在溶劑中，加熱到一定溫度后，緩慢降溫得到共晶。

1.3.4共晶單晶培養(yǎng)及測試 ①混懸后的溶液離心或濾過后，濾液置于小燒杯中，封口膜封好，針扎數(shù)小孔，任其揮發(fā)。②取過量的API和CCF，加入EP管中，加入能混懸出共晶的溶劑(一般3～4 mL)，超聲振蕩10～20 min，使API和CCF充分溶解，過濾，揮發(fā)。

1.3.5小量制備樣品 確定合適溶劑，按摩爾比1：1的比例投料，反應一定時間后樣品測PXRD，若共晶中沒有原料藥和CCF的峰，過濾(水泵抽濾)，用原溶劑洗滌除去母液(小心洗滌，2或3次)，干燥。干燥后的樣品測PXRD，如沒有雜峰，進行純度表征(磁共振譜和元素分析)。

1.3.6晶型樣品表征 ①粉末X射線衍射法(PXRD)：精密稱取原料藥和晶型樣品各50 mg，進行實驗。②單晶X射線衍射(SCXRD)：石墨單色器，Mo-K 射線(γ=0.710 73 ?)；溫度：295(2)K；電壓：20 kV；電流：5 mA[12]。③差示掃描量熱法(DSC)：稱取晶型樣品適量，采用程序升溫法對樣品進行DSC表征，溫度范圍為：30～200 ℃。④熱重分析法(TG)：采用熱重分析法，對共晶樣品晶型進行進一步表征研究，確定是否含有溶劑，升溫速率為10 K·min-1。⑤熔點法(MP)：用熔點法對晶型樣品進行表征，每個晶型平行測定3次，取平均值。雌二醇的熔點是：175～180 ℃。⑥磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)：本實驗采用磁共振氫譜，以DMSO為溶劑。

1.3.7穩(wěn)定性研究 ①高溫實驗：將晶型樣品置于60 ℃溫度條件下10 d，并于放置的第0天、第5天和第10天分別取樣。②高濕實驗：將晶型樣品置于25 ℃相對濕度(90±5)%條件下放置10 d，并于放置的第0天、第5天和第10天分別取樣。③光照實驗：將晶型樣品置于光照箱10 d，光照強度設置為(4500±500)lx，于放置的第0天、第5天和第10天分別取樣。

1.3.8溶解度實驗 溶解曲線測定采用槳法，溶出介質(zhì)：水、pH值1.2的鹽酸-氯化鈉緩沖液、pH值4.5醋酸鹽緩沖液、pH值6.8的磷酸鹽緩沖液、0.2%SDS溶液、0.5%SDS溶液；體積：600 mL；溫度：37 ℃；轉(zhuǎn)速：100 r·min-1。參照溶解度的測定方法進行測定。稱取共晶樣品120 mg，置于100 mL三角錐形瓶中，定量移取100 mL溶液加入，搖勻后加入溶出儀的溶杯中再加至600 mL，分別在計時開始后的5，15，30，60，120，240，300和360 min用注射器抽取樣品，濾過，將濾液照紫外-可見分光光度法，波長為280 mm處測定其吸光度。利用吸光度數(shù)據(jù)對樣品溶解的質(zhì)量百分比進行計算，以時間為橫坐標，溶解的樣品的相對量為縱坐標分別繪制溶解度曲線[13]。

2 結(jié)果

2.1原料藥表征結(jié)果 雌二醇原料藥的PXRD、IR、TGA-DSC、NMR圖譜分別如圖1所示。雌二醇原料藥的DSC數(shù)據(jù)見表1，雌二醇原料藥熔點：初熔169.2 ℃，終熔179.2 ℃，熔距10 ℃，放置時間久，原料藥中可能含有水分導致熔距增大。

2.2溶解性實驗結(jié)果 結(jié)果表明，雌二醇是一種不易溶于水且也不易溶于有機試劑的化學物質(zhì)，在24種溶劑中的溶解性質(zhì)主要分為3類：①溶解溶劑(13種)：丙酮、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙腈、四氫呋喃、吡啶、三氯甲烷、二氯甲烷、DMF、DMSO、苯、甲苯、二甲苯；②微溶溶劑(7種)：甲醇、乙醇、95%乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙醚；③不溶溶劑(4種)：水、正己烷、環(huán)己烷、石油醚。

2.3共晶單晶樣品制備 實驗共得到雌二醇共晶樣品2種：共晶Ⅰ(雌二醇-尿素共晶)；共晶Ⅱ(雌二醇-乙酰胺)，其中共晶Ⅱ為首次發(fā)現(xiàn)。制備方法：共晶Ⅰ：雌二醇和尿素按照摩爾比1：1混合置于5 mL棕色玻璃瓶中后加入丙酮2～3 mL，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速800 r·min-1，攪拌10 h，抽濾后濾液室溫下自然揮發(fā)溶劑培養(yǎng)單晶。共晶Ⅱ：雌二醇和乙酰胺摩爾比1：1混合后加入乙酸乙酯2～3 mL，磁力攪拌轉(zhuǎn)速800 r·min-1，攪拌10 h，抽濾后濾液室溫下自然揮發(fā)溶劑培養(yǎng)單晶。

2.4晶型表征

2.4.1PXRD結(jié)果 共晶在API雌二醇于2θ=11.67°，13.26°，18.28°，26.68°處的強衍射峰消失，在CCF尿素2θ=24.94°，29.61°，31.98°，35.86°，40.78°的特征峰消失，但是共晶在2θ=16.37°，21.42°，22.29°等處出現(xiàn)了新的衍射峰，這些衍射峰不屬于API和CCF，所以判定出現(xiàn)了不同于兩者的新的物質(zhì)。見圖2。制得的共晶在API雌二醇于2θ=11.66°，13.26°，14.59°處的衍射峰消失，在CCF乙酰胺2θ=25.01°，26.948°，31.09°處的特征峰消失，但是共晶在2θ=14.31°，16.04°，20.16°，21.13°等處出現(xiàn)了新的衍射峰，判定出現(xiàn)不同于兩者的新的物質(zhì)。見圖3。

圖2 共晶ⅠPXRD對比圖

圖3 共晶ⅡPXRD對比圖

2.4.2NMR分析結(jié)果 共晶Ⅰ在化學位移5.4 ppm的位置出現(xiàn)了峰面積為4的新峰，而原本雌二醇中化學位移為2.1 ppm處的氫原子峰面積為2，2.2 ppm處峰面積為1的峰，現(xiàn)在是成了化學位移2.2 ppm處峰面積3的峰。見圖4。

圖4 E2及兩種共晶的NMR圖譜

上述圖譜中各物質(zhì)的化學位移及累計氫原子的數(shù)量與原料藥雌二醇有所不同，所制備的物質(zhì)的氫原子個數(shù)是各組分的氫原子之和，由此，初步判斷在摩爾比1：1的情況下，所制備的物質(zhì)是雌二醇的共晶或者溶劑合物。

2.4.3SCXRD單晶圖譜 單晶X射線衍射結(jié)果顯示兩種共晶分子比例分別為1：1，4：4，即對共晶Ⅰ來說，一個晶胞內(nèi)包含1分子雌二醇和1分子尿素，而在一個共晶Ⅱ的晶胞內(nèi)包含4分子雌二醇和4分子乙酰胺。見圖5。

圖5 共晶Ⅰ(A)和共晶Ⅱ(B)的單晶圖

2.4.4雌二醇共晶的單晶分析 見圖6、圖7。圖6A、圖7A中可以看出雌二醇和尿素及乙酰胺配體的氫鍵結(jié)合方式及位置，共晶Ⅰ以O1--H1…O3、N1--H1B…O1等氫鍵相互作用，共晶Ⅱ以O1--H1…O4、N1--H1B…O1等氫鍵相互作用，藍色虛線表示分子間的氫鍵相互作用力，具體氫鍵數(shù)據(jù)見表2，3。兩種共晶在晶胞中的排列方式如圖6B、7B所示，兩種共晶的晶體學數(shù)據(jù)見表4，共晶單晶結(jié)構(gòu)中的各原子的二維平面序列見圖6C、7C。兩種雌二醇的共晶單晶，其中共晶Ⅰ屬于正交晶系，空間群P212121，晶型共晶Ⅱ?qū)儆趩涡本?，空間群為P21。

2.4.5DSC-TAG結(jié)果 尿素熔點132 ℃，TG圖譜在分解(247 ℃)之前有一次明顯的失重(160 ℃)，失重至40%。如圖8所示，共晶Ⅰ在227 ℃時出現(xiàn)尖銳且強的單獨吸熱峰，具體溫度見表5，與圖9中API雌二醇的熔點(178～179 ℃)和CCF尿素熔點(132 ℃)不同，且高于兩者。在160 ℃時出現(xiàn)尖銳且強烈的單獨吸熱峰，與API雌二醇原料藥的熔點(178～179 ℃)和CCF乙酰胺熔點(81 ℃)不同，介于兩者之間。見圖8，9。

2.4.6熔點法表征 采用熔點儀對兩種共晶樣品進行熔點測定，升溫速率：1.0 ℃·min-1，2種晶型的熔點數(shù)據(jù)見表6。

2.5晶型評價

2.5.1穩(wěn)定性評價 兩種共晶物質(zhì)在高溫、高濕、一定光照條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見表7。穩(wěn)定性PXRD對比圖10中，從上到下依次是：初始雌二醇原料藥；高溫、高濕、光照10 d后的雌二醇原料藥；初始共晶Ⅱ；高溫、高濕、光照10 d后的共晶Ⅱ；初始共晶Ⅰ；高溫、高濕、光照10 d后的共晶Ⅰ。PXRD圖譜中兩種共晶和原料藥的峰位置、峰形狀都沒有發(fā)生明顯的變化。穩(wěn)定性評價結(jié)果表明：與雌二醇原料藥類似，共晶Ⅰ和共晶Ⅱ都是較穩(wěn)定的晶型。

圖6 共晶Ⅰ的氫鍵結(jié)合圖(A)、晶胞堆積圖(B)和單晶結(jié)構(gòu)圖(C)

表2 共晶Ⅰ的氫鍵數(shù)據(jù)表 P21 21 21 R=0.04

2.5.2溶出度評價 溶出度實驗結(jié)果見圖11。

①用pH值1.2介質(zhì)為溶出介質(zhì)時，兩種共晶的累計溶出度都明顯提高，共晶Ⅱ溶約60%，共晶Ⅰ約溶出47%，而雌二醇原料藥晶型溶出為33%，溶出介質(zhì)區(qū)分度好，溶出速率兩種共晶也高于原料藥晶型。

②用pH值4.5介質(zhì)為溶出介質(zhì)時，共晶Ⅱ溶約46%，共晶Ⅰ約溶出37%，而雌二醇原料藥晶型溶出37%。

③用pH值6.8介質(zhì)為溶出介質(zhì)時，共晶Ⅱ溶約27%，共晶Ⅰ約溶出23%，而雌二醇原料藥晶型溶出17%，溶出介質(zhì)不能很好的區(qū)別開三者。

④用水為溶出介質(zhì)時，300 min晶型I、晶型Ⅱ幾乎沒有溶出。

⑤用0.2%SDS溶液為溶出介質(zhì)時，原料藥晶型累計溶出20%，共晶Ⅰ溶出25%，共晶Ⅱ溶出29%，且兩種共晶速率高于原料藥晶型，介質(zhì)區(qū)別度不大。

⑥用0.5%SDS溶液為溶出介質(zhì)時，原料藥晶型累計溶出25%，共晶Ⅰ溶出32%，共晶Ⅱ溶出39%，且兩種共晶速率高于原料藥晶型。

由實驗結(jié)果可知，在水中3種物質(zhì)的溶解度小。兩種共晶在6種介質(zhì)中的溶出行為基本一致，都可達到溶出平衡，沒有達到完全溶出。在pH值=1.2鹽酸緩沖溶液中，共晶Ⅱ的累計溶出度比雌二醇原料藥大近2倍，比共晶Ⅰ大1.2倍，且共晶Ⅱ的溶出速率高于共晶Ⅰ。

圖7 共晶Ⅱ的氫鍵結(jié)合圖(A)、晶胞堆積圖(B)和單晶結(jié)構(gòu)圖(C)

表3 共晶Ⅱ的氫鍵數(shù)據(jù)表 P21 21 21 R=0.07

表4 兩種共晶結(jié)構(gòu)參數(shù)表

圖8 共晶Ⅰ(A)和共晶Ⅱ(B)TGA-DSC圖

表5 兩種共晶的放熱峰對比表

圖9 尿素(A)和乙酰胺(B)標準品TGA-DSC圖

表6 兩種共晶熔點數(shù)據(jù)表

表7 兩種共晶的穩(wěn)定性考查數(shù)據(jù)表

3 討論

結(jié)晶是一個復雜的過程，影響結(jié)晶的因素包括結(jié)晶的工藝和條件以及賦形劑和其他添加劑的影響。近年來，創(chuàng)新藥物研發(fā)領域?qū)λ幬锞脱芯吭絹碓街匾暋?/p>

圖10 共晶Ⅰ、共晶Ⅱ與原料藥的穩(wěn)定性PXRD對比圖

A.0.1 mol·L-1鹽酸溶液(pH=1.2)；B.醋酸溶液(pH=4.5)；C.磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)；D.水(pH=7.0)；E.0.2%SDS溶液(pH=7.0)；F.0.5%SDS溶液(pH=7.3)。

FDA近年審批上市的小分子新藥中，涉及晶型的高達66%?！八幬锞脱芯考夹g(shù)”已成為化學藥物研究關鍵技術(shù)之一。2015年版《中華人民共和國藥典》則新增“藥品晶型研究及晶型質(zhì)量控制指導原則”作為新藥研發(fā)及藥物質(zhì)控的參照標準[14]。

所謂共晶，API和CCF按固定化學計量比在氫鍵或其他非共價鍵的作用下自組裝形成的超分子復合物[15]。共晶具有以下特點：①中性分子即可以作為共晶組成部分。②潛在CCF很多，比如藥用輔料、食品添加劑、氨基酸以及其他活性分子[16]。③有效的提高難溶性API的溶解性能，改善藥物的理化性質(zhì)、機械性能及生物利用度等。形成共晶并沒有打破藥物的共價鍵，原料藥的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此開發(fā)已上市藥物的共晶的過程(包括臨床試驗)和成本要遠遠小于新化學分子實體(NCEs)，周期也會大大縮短。所以，目前國內(nèi)對于藥物共晶的研究已經(jīng)成為繼藥物多晶型研究之后的又一個研究熱點。

雌二醇藥理作用為調(diào)控女性的月經(jīng)周期、控制性征、附屬性器官的成熟[20]，臨床使用廣泛可用于更年期綜合征等補充雌激素不足類疾病、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、口服避孕藥等。但其存在生物利用度低(約10%)的不足，因此本課題組致力于尋找其新晶型或共晶以提高藥物的穩(wěn)定性和臨床療效，前期研究已經(jīng)獲得一種雌二醇的新溶劑合物[21-22]。文獻檢索發(fā)現(xiàn)，截至目前雌二醇有半水、一水合物，甲醇、乙醇、正丙醇的溶劑合物等形式[23-24]，但共晶研究甚少。

藥物共晶的本質(zhì)是根據(jù)API和CCF的官能團互補性來設計氫鍵超分子合成子，了解API的結(jié)構(gòu)、官能團及所含氫鍵供體和受體的種類、數(shù)目和位置等至關重要。因此，我們首先對雌二醇的原料藥進行了PXRD、溶解性等檢測分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌二醇不易溶于水也不易溶于有機試劑，含有兩個醇羥基，理論上能與含有羧基、羰基、氨基等基團的化合物形成氫鍵，故可能形成共晶。常用CCF主要有藥用輔料、鹽性藥物中的成鹽離子、食品添加劑等5類。

共晶的制備方法與晶型藥物的制備相同，因此本文采用了研磨法、混懸法等四種制備方式盡可能多的獲得藥物共晶相，表征分析后發(fā)現(xiàn)共獲得雌二醇的2種共晶晶型：共晶Ⅰ雌二醇-尿素共晶和共晶Ⅱ雌二醇-乙酰胺共晶，其中共晶Ⅱ為首次發(fā)現(xiàn)。實驗中還得到了雌二醇-甲醇-水合物，也是首次發(fā)現(xiàn)的含有兩種溶劑分子的溶劑合物。表征分析中，SXRD證明了雌二醇存在多晶型現(xiàn)象主要是由于分子構(gòu)象中分子的排列、結(jié)晶溶劑的介入、晶胞參數(shù)等的差異，解釋了非共價鍵作用力在形成共晶的重要作用。結(jié)合PXRD圖譜證明制備的雌二醇晶型物質(zhì)為高晶型純品，為其他晶型表征手段提供了參照基礎。在NMR圖譜中可以看出，新制得各物質(zhì)的化學位移及累計氫原子的數(shù)量與原料藥雌二醇有所不同，由此，可以初步判斷所制備的物質(zhì)可能是雌二醇的共晶或者溶劑合物，但還需要進一步的檢測來支持。從熱分析圖譜(DSC/TGA)可進一步得出兩者是形成新的共晶的結(jié)論。

筆者采用了初步的穩(wěn)定性和溶出度評價對獲得的共晶性質(zhì)進行進一步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共晶Ⅰ以及共晶Ⅱ?qū)俜€(wěn)定型，且共晶Ⅱ的溶出性質(zhì)更優(yōu)，證實通過共晶API的溶解性得到一定改善。共晶提高藥物溶解度和溶出速率時因先溶解為無定型狀態(tài)而常會出現(xiàn)彈跳-傘降現(xiàn)象，本文中并未觀察到此結(jié)果。因此，雌二醇優(yōu)勢共晶的最終確定還需進行生物利用度和藥動學等研究加以判斷。本文通過對雌二醇共晶進行了系統(tǒng)的初步篩選和檢測，證實雌二醇能形成共晶(獲得一種新共晶)，且不同共晶理化性質(zhì)存在差異，為雌二醇的研發(fā)提供了思路和可供參考的數(shù)據(jù)，對提高其臨床藥效和臨床應用具有重要的意義。