梁麗英，陳晶，張永琴，藍(lán)艷梅，劉歡

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，南寧 530023)

隨著人口快速老齡化，急性心肌梗死引起的死亡率不斷上升，對(duì)其的防治任務(wù)日益艱巨[1]，急性心肌梗死最理想的治療措施是在冠狀動(dòng)脈已通的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)心肌水平的完全再灌注。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在經(jīng)過一段時(shí)間缺血后，重新獲得血液供應(yīng)，將會(huì)導(dǎo)致該部位心肌結(jié)構(gòu)和功能的損傷，進(jìn)一步加重心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfu-sion injury，MIRI)。如何降低MIRI的發(fā)生具有極為重要的臨床意義。研究表明心肌細(xì)胞損傷是存在于多種心血管疾病中的共同病理現(xiàn)象，微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)在抗心肌細(xì)胞損傷上具有重要作用[4]，其通過調(diào)節(jié)其靶基因人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome tengene，PTEN)，調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡、增殖，參與氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[2-4]。

從中草藥中分離高效低毒活性成分，用于心肌梗死防治，是該領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[5-7]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-Ⅳ)是從中藥黃芪中分離得到的一種皂苷類化合物。藥理學(xué)研究顯示，黃芪甲苷對(duì)心血管系統(tǒng)主要有強(qiáng)心、耐缺氧、保護(hù)缺血心肌損傷等作用[8-9]，其作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過建立對(duì)缺氧復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，利用流式細(xì)胞技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)、免疫熒光等技術(shù)分析和探討miR-21/PTEN途徑在黃芪甲苷保護(hù)心肌細(xì)胞損傷過程中的作用機(jī)制，以期為黃芪應(yīng)用于臨床治療心肌缺血引起的心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 心肌細(xì)胞H9c2，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供 。

1.2藥品與試劑 黃芪甲苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，每瓶20 mg，貨號(hào)：84687-43-4)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為C11885500BT，16000-044)；二甲亞砜(DMSO，索萊寶，批號(hào)：0231-100)為分析純； 0.25% 胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Gibco，批號(hào)：25200056)；磷酸鹽緩沖液(PBS，索萊寶，批號(hào)：P1022-500)；凋亡試劑盒Annexinv-APC/PI(美國(guó)BD公司，批號(hào)：7180833)；細(xì)胞色素C(Cyt-c，上海江萊生物科技有限公司，貨號(hào)：JL11434)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A)以及熒光定量檢測(cè)試劑盒(TB GreenTM Premix ExTaqTM II，RR820A)均購(gòu)自大連寶生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)試劑盒(武漢博士德，貨號(hào)：EK1425)；CCK-8試劑(cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁，貨號(hào)：CK04)；小鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2 基因( B-cell lymphoma-2，Bcl-2，武漢博士德，貨號(hào)：BM0200) 單 克 隆 抗 體；miR-21 模擬物(miR-21mimic) 和 miR-21抑制物 (miR-21 inhibitor)慢病毒由上海吉?jiǎng)P生物公司包裝合成，測(cè)定病毒滴度后置于-80 ℃保存。

1.3儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼，CytoFlex)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf，5410)、生物安全柜(BIOBASE，BSC-3FA2)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛)、三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛HERAcell 150i)、酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛)、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，IX71)、7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng) (美國(guó)Applied Biosystems)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R) 模型建立[8]H9c2接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過條件摸索確定H9c2缺氧復(fù)氧模型復(fù)制方法：細(xì)胞傳代鋪板常規(guī)培養(yǎng)24 h后，缺氧缺糖培養(yǎng)12 h(換成無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)基后，置于三氣培養(yǎng)箱中 (1%O2，94%N2，5%CO2)孵育12 h，再?gòu)?fù)氧6 h(換成培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h)。

1.4.2miR-21過表達(dá)(miR-21 mimic)和干擾 miR-21(miR-21 inhibitor)慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將H9c2單細(xì)胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(5×105個(gè)·mL-1)，待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，按照50 MOI(multiplicity of infection，MOI)的接種病毒量分別接種miR-21過表達(dá)和干擾慢病毒至H9c2細(xì)胞，接種病毒后12 h吸棄培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率>90%達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，為穩(wěn)定表達(dá)miR-21 mimic 或 miR-21 inhibitor細(xì)胞，傳代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.3篩選合適心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的黃芪甲苷濃度

①藥物黃芪甲苷的制備：根據(jù)前期的研究及參考文獻(xiàn)[8-10]，選用黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品，用時(shí)用DMSO溶解(DMSO終濃度<0.1%)。

②黃芪甲苷對(duì)H9c2細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞增殖的影響：將一定量的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)·mL-1的密度加入96 孔培養(yǎng)板上中間的孔中，細(xì)胞懸液每孔100 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁過夜，換成無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)基后，置于三氣培養(yǎng)箱中 (1%O2、94%N2、5%CO2)孵育12 h，缺氧處理后將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后以建立缺氧/復(fù)氧模型。造模同時(shí)分別向各孔加入10 μL 以下各組藥物( 黃芪甲苷0，25，50，100， 200 μmol·L-1)，每組6個(gè)孔，作用至72 h。向每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度(A值)，篩選黃芪甲苷對(duì)H9c2細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞增殖的影響。

1.4.4細(xì)胞分組與處置 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，傳代鋪板后隨機(jī)分為以下6組：正常組 (正常培養(yǎng)72 h)、H/R模型組 (缺氧復(fù)氧造模)、H/R+miR-21 mimic組(造模前預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-21 mimic )、H/R+miR-21 inhibitor組 (造模前預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor)、H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ(造模和AS-Ⅳ干預(yù)之前預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組，造模同時(shí)予200 μmol·L-1AS-Ⅳ干預(yù)至72 h)、H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ(造模和AS-Ⅳ干預(yù)之前預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，造模同時(shí)予200 μmol·L-1AS-Ⅳ干預(yù)至72 h) 。

1.4.5qRT-PCR檢測(cè)PTEN、miR-21基因的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求，經(jīng)藥物孵育72 h后用胰酶消化收集所有細(xì)胞使用TRizol法提取細(xì)胞總RNA，使用Nandrop2000進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)后，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)NCBI參考序列，設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠PTEN、的特異性PCR引物，PTEN (上游序列：ATTCCCAGTCAGG-CGCTA；下游序列：TCACCTTTAGCTGGCAGACC)，擴(kuò)增根據(jù)TB GreenTM Premix ExTaqTM II，RR820A試劑盒說明書，擴(kuò)增后的原始CT值采用2-△△CT方法計(jì)算后分析目的基因PTEN的相對(duì)表達(dá)水平。

使用天根miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各組細(xì)胞miRNA后，使用miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)所得miRNA同步進(jìn)行加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物采用miRcute增強(qiáng)型 miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR擴(kuò)增后的原始CT值采用2-△△CT方法計(jì)算后進(jìn)行相對(duì)定量分析基因表達(dá)水平。

1.4.6用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求處理，經(jīng)藥物孵育72 h后用不含EDTA的胰酶消化收集所有細(xì)胞胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按凋亡試劑盒說明書，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 mL的流式管中，加入Annexinv-APC和PI各5 μL，同時(shí)設(shè)定對(duì)照：對(duì)照1，單純的活細(xì)胞，不加任何染料；對(duì)照2，活細(xì)胞只加Annexinv-APC；對(duì)照3，活細(xì)胞只加PI，輕輕混勻，室溫、避光孵育15 min，加入連接緩沖液400 μL，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析結(jié)果。

1.4.7用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和細(xì)胞色素C(Cyt-C)的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求經(jīng)藥物孵育72 h后用胰酶消化收集所有細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)大于1×106個(gè)·mL-1，用預(yù)冷PBS洗1次，將細(xì)胞重懸于PBS中，反復(fù)凍融3次后3000 r·min-1離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書要求檢測(cè)。

1.4.8免疫熒光檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，貼壁過夜，按分組要求處理，細(xì)胞按要求處理后，從培養(yǎng)箱中取出，PBS洗3次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次；0.5%Trito-X-100室溫通透20 min；PBS洗3次，吸水紙吸干PBS，在培養(yǎng)孔里滴加正常的山羊血清，封閉30 min；吸水紙吸干封閉液，每孔滴加一抗并放入濕盒，4 ℃過夜；PBS洗3次，加入二抗，濕盒中孵育1 h，PBS洗3次；復(fù)染核，滴加DAPI避光5 min，洗去多余的DAPI，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在方差齊性的前提下通過One-Way ANOVA分析進(jìn)行各組樣本均數(shù)間的多重比較，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果 熒光相差倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)完整，呈纖維狀，轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞攜帶熒光(綠色)，流式檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率>90%，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

2.2黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞H9c2增殖的影響 與0 μmol·L-1黃芪甲苷組比較，200 μmol·L-1的黃芪甲苷作用于細(xì)胞，吸光度A值顯著提高，A值與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，根據(jù)增殖的能力，選用200 μmol·L-1的黃芪甲苷作用于細(xì)胞作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。見表1。

2.3黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞H9c2 miR-21、PTEN表達(dá)的影響 與H/R模型組比較，正常對(duì)照組、H/R+miR-21 mimic組 miR-21的表達(dá)量增加、PTEN表達(dá)量明顯減少，H/R+miR-21 inhibitor組miR-21的表達(dá)量下降、PTEN表達(dá)量明顯增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組miR-21的表達(dá)量增加，PTEN表達(dá)量明顯減少；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組miR-21的表達(dá)量增加、PTEN表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.4黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞H9c2凋亡百分率的影響 與H/R模型組比較，正常對(duì)照組、H/R+miR-21 mimic組凋亡百分率降低，H/R+miR-21 inhibitor組凋亡百分率增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組凋亡百分率降低；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組miR-21的凋亡百分率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2和表3。

2.5黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞H9c2 Caspase-3、Cyt-C表達(dá)的影響 與H/R組比較，正常對(duì)照組、H/R+miR-21 mimic組Caspase-3和Cyt-C的表達(dá)降低，H/R+miR-21 inhibitor組Caspase-3和Cyt-C的表達(dá)增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組Caspase-3和Cyt-C的表達(dá)降低；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Caspase-3和Cyt-C的表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.6黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞H9c2 Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與H/R組比較，正常對(duì)照組、H/R+miR-21 mimic 組形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，如圖藍(lán)色熒光顯示，Bcl-2蛋白(表達(dá)紅色熒光)的表達(dá)量減少，與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+ miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Bcl-2的表達(dá)量減少；與H/R+ miR-21 inhibitor組比較，H/R+ miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Bcl-2的表達(dá)量減少，如圖3所示。

3 討論

國(guó)家心血管病中心編撰出版的《中國(guó)心血管病報(bào)告2019》[1]指出，中國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。心血管疾病中以急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的臨床癥狀最為嚴(yán)重，研究AMI的發(fā)生、發(fā)展過程，尋求有效的治療藥物尤為重要。miR-21及其靶基因 PTEN 在心血管疾病調(diào)控的過程中發(fā)揮的作用受到人們的關(guān)注，其對(duì)心臟的保護(hù)作用被證實(shí)[11]。研究表明，miR-21 可以通過抑制其靶基因PTEN的表達(dá)而減輕急性心梗后心肌功能的損傷，同時(shí)減少心肌細(xì)胞的凋亡，明顯地抑制氧化應(yīng)激及缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)采用研究心肌保護(hù)作用常用的體外模型H9c2細(xì)胞，模擬心肌細(xì)胞的缺血再灌注，通過體外缺氧/復(fù)氧的模型，試圖從調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)水平及其對(duì)靶基因PTEN的調(diào)節(jié)尋求黃芪甲苷對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制及靶點(diǎn)。

圖1 心肌細(xì)胞H9c2轉(zhuǎn)染形態(tài)圖(×100)

表1 黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞H9c2增殖的影響

結(jié)果顯示，黃芪甲苷能明顯抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡。黃芪甲苷能上調(diào)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞miR-21的表達(dá)量，進(jìn)一步下調(diào)損傷心肌細(xì)胞PTEN的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。Bcl-2是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子，Caspase-3是凋亡過程中的執(zhí)行分子，缺氧復(fù)氧損傷可誘導(dǎo)線粒體腫脹，增加線粒體膜的通透性，當(dāng)線粒體接收到凋亡刺激信號(hào)，通過釋放內(nèi)外膜間隙里的促凋亡因子，如Cyt-C等，進(jìn)一步激活下游凋亡通路的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶相關(guān)蛋白(Caspase)，包括Caspase-9和Caspase-3，參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷后，黃芪甲苷能減少Cyt-C、Caspase-3的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。

表2 黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞H9c2 miR-21、PTEN表達(dá)的影響

A.正常對(duì)照組；B.H/R模型組；C.H/R+miR-21 mimic 組；D.H/R+ miR-21 inhibitor組；E.H/R+miR-21 mimic +AS-Ⅳ組；F.H/R+miR-21 inhibitor +AS-Ⅳ組。

表3 黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞H9c2 凋亡率的影響

表4 黃芪甲苷對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞H9c2 Caspase-3、Cyt-C表達(dá)的影響

Tab.4 The effect of Astragaloside on the expression level of Caspase-3 and Cyt-C in hypoxia/reoxygenation injury

組別Caspase-3Cyt-c正常對(duì)照組0.63±0.75①1.49±0.13①H/R模型組3.03±0.182.76±0.20H/R+miR-21 mimic組2.35±0.60①2.18±0.12① inhibitor組3.57±0.08①3.71±0.09① mimic+AS-Ⅳ組41.46±0.14①②1.50±0.12①②inhibitor+AS-Ⅳ組2.02±0.13①③2.35±0.28①③F42.9096.74P0.000.00

A.正常對(duì)照組；B.H/R模型組；C.H/R+miR-21 mimic 組；D.H/R+ miR-21 inhibitor組；E.H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組；F.H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組。

綜上所述，黃芪甲苷抑制缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是上調(diào)了miR-21的表達(dá)，靶向調(diào)控PTEN，抑制了相關(guān)促凋亡因子Cyt-C、Caspase-3的釋放。 miR-21作為一類具有重要調(diào)控作用的內(nèi)源性小分子廣泛參與了機(jī)體多種生物學(xué)過程的調(diào)控，它在心血管系統(tǒng)多種生理、病理過程也具有重要的調(diào)控作用。從miR-21對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)控和作用機(jī)制研究心血管疾病，將有助于發(fā)現(xiàn)更多天然藥物對(duì)心血管疾病的作用靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H選擇了心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧離體損傷模型，為進(jìn)一步確證黃芪甲苷對(duì)缺血性心臟疾病的保護(hù)作用，下一步仍需進(jìn)行大鼠心肌缺血等整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。