劉樹華 陳桐瑩 趙宇 王世浩 王若琳 張桂鑫 黃宏興 萬雷*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第六臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518034 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510375

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是中老年人常見的疾病，主要特點(diǎn)是骨量丟失加重、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險增加[1]。骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折的治療和護(hù)理不論對于家庭還是社會都會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。2015年的一項預(yù)測顯示[2]，2035年我國骨質(zhì)疏松性骨折的醫(yī)療費(fèi)用將會達(dá)到199.2億美元，而到2050年將會達(dá)到254.3億美元。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特點(diǎn)為起病隱匿并且進(jìn)行性發(fā)展，病因迄今未明。據(jù)預(yù)測，到2050年，AD患者將增長到1.35億，約每33 s就會出現(xiàn)一例AD[3-4]。阿爾茨海默癥的治療和護(hù)理同樣伴隨著沉重的負(fù)擔(dān)。

OP和AD看似兩種發(fā)生在不同系統(tǒng)的相互獨(dú)立的疾病，但是兩者都是老年人常見的疾病，同時AD與OP有著共同的影響因素：年齡、睡眠質(zhì)量、吸煙、酗酒、生活經(jīng)濟(jì)地位、雌激素水平、運(yùn)動、體質(zhì)量指數(shù)[5-6]。

關(guān)于OP與AD的關(guān)系，有研究認(rèn)為AD是OP的危險因素[7]。AD患者面臨骨密度低水平及髖部骨折的風(fēng)險提高近兩倍[8]，由于AD患者晝夜節(jié)律改變，他們活動時間更多集中在晚上，而白天昏昏欲睡，并且這些癥狀隨著認(rèn)知功能不斷惡化更加明顯，這將導(dǎo)致他們?nèi)狈m當(dāng)?shù)膽敉怏w育鍛煉和陽關(guān)照射，誘發(fā)或加重OP[8-9]。

另有學(xué)者認(rèn)為OP與AD存在共同致病因素并促進(jìn)兩病的發(fā)展。AD的一個病理特點(diǎn)是大量β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)在大腦神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成老年斑。有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在骨質(zhì)疏松性骨組織中水平升高，且Aβ的表達(dá)水平與骨密度水平呈負(fù)相關(guān)[7,10]。除此之外，載脂蛋白4(APOE4)是一種主要的膽固醇載體，能夠與Aβ結(jié)合而促進(jìn)Aβ的沉積，是公認(rèn)的阿爾茨海默病的遺傳風(fēng)險因素[11]，APOE4基因也被發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)，其中具有APOE 4等位基因的女性患髖部骨折的可能性是沒有APOE 4等位基因的女性的兩倍[12]。關(guān)于Aβ和APOE4基因在AD與OP中的確切關(guān)系仍需要強(qiáng)有力的證據(jù)。這提示可以分析兩病中特異性較高的交集基因探索OP和AD的關(guān)系。

MiRNA是短的非編碼核糖核苷酸，長度為19～25個核苷酸，其作用是通過抑制翻譯或使mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。目前研究OP與AD的關(guān)系很少深入到非編碼RNA方面，通過結(jié)合miRNA和生物信息學(xué)研究OP與AD關(guān)系的報道更為稀缺。

本研究通過對基因芯片GSE147232、GSE93883分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析并篩選兩基因芯片DEmiRNAs，分別預(yù)測與這些DEmiRNAs的靶向基因，為闡明OP與AD的關(guān)系以及相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 收集數(shù)據(jù)

從GEO公共數(shù)據(jù)庫中查詢OP與AD患者的基因芯片，下載OP基因芯片GSE93883，芯片包含12個骨質(zhì)疏松癥患者的樣本和6個健康人的樣本，在骨質(zhì)疏松癥患者的樣本中有6例為骨質(zhì)疏松癥伴椎體骨折患者，另外6例為骨質(zhì)疏松癥無椎體骨折患者。本研究將骨質(zhì)疏松不伴椎體骨折患者的樣本和骨質(zhì)疏松伴椎體骨折患者的樣本分別與健康人樣本做獨(dú)立分析，其中篩選條件為P<0.05和∣logFC∣≥1，發(fā)現(xiàn)伴椎體骨折患者的DEmiRNAs與不伴椎體骨折患者的DEmiRNAs具有較大的差異，其中OP不伴椎體骨折患者的DEmiRNAs有268個、OP伴椎體骨折患者的DEmiRNAs有270個，但是兩者交集的miRNAs僅有133個。通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)，有研究表明骨折后血清中miRNA會發(fā)生相應(yīng)的改變，但無法確定這些miRNA是導(dǎo)致骨折的原因還是發(fā)生骨折后機(jī)體產(chǎn)生的其他改變[14]。為了避免椎體骨折后產(chǎn)生的誤差，本研究將基因芯片中6例為骨質(zhì)疏松癥伴椎體骨折患者的樣本舍去。下載AD基因表達(dá)芯片GSE147232，芯片包含6個正常老化的樣本和6個阿爾茨海默癥的樣本。

1.2 差異表達(dá)的miRNA

使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的GEO2R在線分析(該工具能夠?qū)x定的組別進(jìn)行分析，自動篩選出差異表達(dá)的基因)，篩選出兩個基因芯片DEmiRNAs。對生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.01和∣logFC∣≥1作為條件，再用Venny 2.1篩選出OP與AD相交集的DEmiRNAs。

1.3 預(yù)測DEmiRNAs的靶基因

目前用來預(yù)測miRNA靶基因的常用數(shù)據(jù)有TargetScan數(shù)據(jù)庫[15]和miRDB數(shù)據(jù)庫[16]。用以上兩個數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測DEmiRNAs的靶基因，通過TargetScan數(shù)據(jù)中自帶的Total context++ score(該分?jǐn)?shù)絕對值越大，靶點(diǎn)可能性越大)，按絕對值高低篩選出前200個靶基因；同樣通過miRDB數(shù)據(jù)中自帶的Target Score，按分?jǐn)?shù)高低篩選出前200個靶基因，再用Venny生成交集基因。

1.4 靶基因富集分析

對篩選后的靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和KEGG 通路分析。GO即基因本體論，是分析基因的常用方法，能通過分析靶基因參與的生物過程(biological pocess，BP)、細(xì)胞組分(clular cmponent，CC)及分子功能(molecular function，MF)對靶基因進(jìn)行分類與注釋。KEGG 通路能分析基因在生物體內(nèi)所參與的代謝過程。本研究使用DAVID數(shù)據(jù)庫的在線分析工具對靶基因進(jìn)行富集分析[17]。GO各項分析及KEGG 信號通路分析的篩選條件均為P<0.01 。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與模型的構(gòu)建

Cytoscape是將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)可視化的一個軟件。本研究將篩選出來的DEmiRNA與篩選出來的靶基因?qū)隒ytoscape中制作miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。STRING(search tool for the retrieval of interacting genes)為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具，能展示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系[18]。

2 結(jié)果

2.1 DEmiRNAs的分析結(jié)果

GEO2R分析后得到10個DEmiRNAs，其中包含hsa-mirplus-c1110，因該miRNA序列目前仍為未知，并且是否存在仍未證實，故在本研究中舍去。DEmiRNAs的變化趨勢與miRNA序列見表1。

表1 篩選后交集的DEmiRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs

2.2 制作miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過上述條件篩選后，得到以下結(jié)果：hsa-miR-4321靶向15個基因，hsa-miR-196a-3p靶向56個基因，hsa-miR-5188靶向7個基因，hsa-miR-4638-5p靶向13個基因，hsa-miR-29b-3p靶向94個基因，hsa-miR-4756-3p靶向47個基因，hsa-miR-3200-3p靶向52個基因，hsa-let-7f-5p靶向13個基因，hsa-miR-550b-3p靶向67個基因。見圖1。

圖1 DEmiRNAs-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 DEmiRNAs-mRNA regulatory network注：菱形為miRNA，圓形為靶基因圖形越大，顏色越深(紅)，則Dgree分?jǐn)?shù)越高。

2.3 GO各項與KEGG 通路的富集分析

富集分析結(jié)果顯示靶基因在BP分析中主要集中在膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)的組成、膠原原纖維的組成等(表2)；在CC的分析中主要集中在膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜、V型膠原三聚體等(表3)；在MF的分析中集中在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合等(表4)；在KEGG pathway的分析中主要集中在蛋白質(zhì)消化吸收、局灶性粘連、ECM受體相互作用、PI3K-Akt等(表5)。

表2 差異靶基因的生物過程分析Table 2 Biological process analysis of differential target genes

表3 差異靶基因的細(xì)胞組分分析Table 3 Cell component analysis of differential target genes

表4 差異靶基因的分子功能分析Table 4 Molecular function analysis of differential target genes

表5 差異靶基因KEGG 通路分析Table 5 Analysis of KEGG pathway of differential target genes

2.4 PPI構(gòu)建與核心基因的篩選

將靶基因?qū)隨TRING中進(jìn)行分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中，使用其自帶的網(wǎng)絡(luò)分析工具，得到各個基因的連接度(degree)。Degree排名前10的基因定義為核心基因，分別為COL1A1(degree=23)、VEGFA(degree=23)、COL4A1(degree=22)、COL3A1(degree=21)、COL5A1(degree=21)、COL2A1(degree=19)、 LOX(degree=18)、COL7A1(degree=18)、IGF1(degree=18)、COL5A2(degree=17)。使用Cytoscape中的MCODE分析PPI網(wǎng)絡(luò)，得到10個集簇，包含45個節(jié)點(diǎn)和128條連線，并展示score 較高的4組集簇(圖3)。

圖2 靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The PPI network of target genes

圖3 分?jǐn)?shù)最高的4組集簇(A的分?jǐn)?shù)為14分，B、C、D的分?jǐn)?shù)為4分)Fig.3 Four sets of clusters with the highest score(A score=14; B, C, D score=4)

3 討論

3.1 DEmiRNAs分析

本研究通過分析基因芯片GSE93883、GPL18058，得到OP與AD差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)而分析OP與AD之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示，degree分?jǐn)?shù)最高的10個核心基因均為hsa-miR-29b-3p的靶基因，這說明OP與AD之前的關(guān)系與hsa-miR-29b-3p有密切的關(guān)系，或許可以作為診斷和治療兩病的一個方向，值得深入研究。有研究表明miR-29b是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)最為明顯的miRNA之一。在BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中，miR-29b主要發(fā)揮著兩方面功能。一方面，miR-29b作為成骨途徑的調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，另一方面，miR-29b充當(dāng)成熟成骨細(xì)胞中膠原合成的衰減劑，以維持分化的表型[19]。與此同時，β-位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)能對APP蛋白連續(xù)水解和裂解，是導(dǎo)致Aβ肽積累的重要機(jī)制之一，被認(rèn)為是抑制Aβ肽產(chǎn)生的主要藥物靶點(diǎn)[20]。miR-29b被證實能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞中BACE1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Aβ肽的產(chǎn)生[21]。因此miR-29可用于治療AD，pre-miR-29b同樣能起到治療AD的作用而且更容易純化[22]。

研究表明單獨(dú)使用miRNA難以起到治療效果，將miRNA放入外泌體中能避免miRNA被降解并能高效地發(fā)揮作用。外泌體是直徑為30～120 nm的囊泡，包含多種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、脂類、代謝產(chǎn)物、mRNA、非編碼RNA[23-25]。用外泌體作為藥物載體時，可以避免潛在的毒性和免疫原性，還能穿透目標(biāo)特定器官[26]。因此由hsa-miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包裝而成的外泌體或許可以用于治療同時患有OP與AD的患者。hsa-let-7f-5p與hsa-mir-550b-3p對OP與AD的關(guān)系缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報道，該miRNA在兩病作用趨勢相反的原因仍需深入研究。

3.2 靶基因分析

10個核心基因中有7個為膠原蛋白家族，大量研究已經(jīng)證明膠原蛋白與骨代謝有重要的關(guān)系。構(gòu)成骨的主要成分為礦物質(zhì)和有機(jī)成分，有機(jī)成分中Ⅰ型膠原蛋白占90%，Ⅰ型膠原蛋白的含量與OP的發(fā)生密切相關(guān)[27]。除此之外，Ⅰ型膠原代謝產(chǎn)生的Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型前膠原羧基端原肽(PICP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTXI)、Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基端肽(NTXI)，被廣泛用于衡量骨代謝水平，對早期診治OP有重要的意義[27]，但是膠原蛋白與AD的關(guān)系鮮有報道，因此膠原蛋白與AD的關(guān)系值得深入研究。

在10個核心基因中，Degree排名同為第一的還有VEGFA基因(degree=23)，VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一員，研究表明VEGF是耦合血管生成和成骨所必需的[28]。VEGF存在多種分泌方式來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能，在骨重建和骨修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[29]。VEGFA在AD的高危人群中同樣具有保護(hù)作用。APOE4等位基因攜帶者是認(rèn)知下降的高度易感人群，VEGF對APOE-4攜帶者具有獨(dú)特的保護(hù)作用[30]。

GO富集分析有利于深入認(rèn)識靶基因的作用和功能，GO各項數(shù)據(jù)表明，靶基因更多富集在膠原蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)的合成過程中，同時證實膠原蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)的合成在OP與AD關(guān)系中的重要性。KEGG通路富集分析顯示與PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路有密切關(guān)系。相關(guān)研究表明，PI3K-Akt信號通路與AD有密切關(guān)系，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SODs)能夠防止過量的活性氧形成過氧化氫，而PI3K/AKT途徑已被證明在神經(jīng)保護(hù)和通過增強(qiáng)SODs的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡方面起著關(guān)鍵作用。這種途徑在阿爾茨海默病中至關(guān)重要，因為它能減少tau蛋白的過度磷酸化[31]。相關(guān)研究證實，阿爾茨海默癥和輕度認(rèn)知障礙受試者的下頂葉的PI3K/Akt/mTOR軸過度活躍[32]。

而對于OP，PI3K/AKT通路被證明能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，達(dá)到抑制OP的效果[33]。mTOR是屬于磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)相關(guān)激酶家族中一員，mTOR與不同的蛋白結(jié)合，能形成功能不同的復(fù)合物，主要為mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。研究證實mTORC1通過抑制NF-κb和NFATc1的相關(guān)通路來抑制破骨細(xì)胞分化，而這兩個因子都是破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[34]。

3.3 OP與AD的關(guān)系

綜合各因素，包括：①OP與AD有許多共同的影響因素，其中年齡、睡眠質(zhì)量、吸煙、酗酒、生活經(jīng)濟(jì)地位、雌激素水平、運(yùn)動在兩病的影響是相同的，僅體質(zhì)量指數(shù)的影響是相反[5-6]；②9個DEmiRNAs中有7個miRNA的變化趨勢呈正相關(guān)，只有2個miRNA為負(fù)相關(guān)，而且miR-29b-3p作為關(guān)鍵miRNA，靶向10個核心基因，其的變化關(guān)系在兩病中為正相關(guān)；③通過查找相關(guān)文獻(xiàn)和報道，預(yù)測的靶基因大部分對兩病的作用趨勢也是相同的。因此認(rèn)為OP與AD存在正相關(guān)關(guān)系，膠原蛋白的缺乏或許是兩疾病的共同病因，而由miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包裝而成的外泌體或許可以作為OP和AD新的治療手段。