陳新亮，陳志寶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

順鉑是一種有效且有前景的化學(xué)治療藥物，可廣泛治療多種腫瘤。然而，使用順鉑的各種重大副作用是不可避免的，例如腎毒性，耳毒性，神經(jīng)毒性和嘔吐，并且順鉑的使用受到限制，其中急性腎損傷（AKI）是造成這類副作用的主要原因[1]。急性腎損傷（AKI）是指由于各種原因引起的腎功能快速下降而引起的臨床綜合征，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）下降，血液中的含氮廢物以及水，電解質(zhì)積累減少和酸堿失衡，尿毒癥的嚴(yán)重全身性并發(fā)癥，細(xì)胞凋亡，壞死，炎癥和細(xì)胞和分子水平的氧化應(yīng)激[2]。減少順鉑引起的AKI是當(dāng)前臨床上化療藥物亟待解決的問(wèn)題。

氧化應(yīng)激是AKI的重要機(jī)制之一。在正常情況下，體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑的產(chǎn)生處于平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被破壞并趨于氧化時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激[3]。氧化應(yīng)激通過(guò)直接產(chǎn)生活性氧（ROS）和代謝產(chǎn)物的鏈反應(yīng)在AKI中起關(guān)鍵作用[4]。NADPH是一種多亞基復(fù)合物，是ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源之一。所謂的活性氧（ROS），概括地說(shuō)，是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成，含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。它們是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧生成的。核因子紅系2相關(guān)因子（Nrf2）是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，并且是通過(guò)誘導(dǎo)一系列抗氧化蛋白的調(diào)節(jié)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中央調(diào)節(jié)劑[5]。根據(jù)研究，Nrf2是內(nèi)源性抗氧化酶的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在氧化性和凋亡性損傷的保護(hù)作用中起關(guān)鍵作用[6]。在體內(nèi)施用腎毒性劑量的順鉑導(dǎo)致腎臟中的壞死和細(xì)胞凋亡顯著增加。有足夠的證據(jù)表明順鉑激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)部線粒體途徑[7]。用順鉑處理的腎上皮細(xì)胞使Bax易位至線粒體并激活caspase[8]。這些證據(jù)表明，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡在AKI中發(fā)揮了重要的作用。

從中草藥植物中提取的化合物是用于治療和預(yù)防各種人類疾病的重要藥物。許多研究表明使用天然產(chǎn)品（例如類黃酮）來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的器官損傷。天然抗氧化劑由于其安全性和天然無(wú)害性，是治療某些困難疾病的良好藥物[9]。香葉木素是從柑橘類植物中提取的天然類黃酮，據(jù)報(bào)道具有各種生物活性，例如抗氧化，抗炎和抗腫瘤[10]。作為良好的抗氧化劑，香葉木素對(duì)某些有害的氧化誘導(dǎo)的反應(yīng)的保護(hù)作用已引起廣泛關(guān)注，尤其是在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和農(nóng)業(yè)化學(xué)領(lǐng)域。關(guān)于香葉木素的幾項(xiàng)體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)肝和肺的損傷具有良好的保護(hù)作用[11-12]。研究旨在評(píng)估香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

香葉木素（純度>99.5%）是從長(zhǎng)春京濤生物技術(shù)有限公司獲得的。3-（4，5-二甲基噻唑-2-y1）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT），二甲基亞砜（DMSO）和DCFH-DA購(gòu)自Sigma Chemical Co.（美國(guó)密蘇里州圣路易斯）。Hoechst33342購(gòu)自invitrogen（美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德）。10%FBS，100 U×mL-1青霉素，100 U×mL-1鏈霉素和3 mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。針對(duì)Nrf2，Keap-1，HO-1，NQO1的抗體購(gòu)自Abcam（美國(guó)馬薩諸塞州劍橋市）。β-肌動(dòng)蛋白購(gòu)自SUNGENE BIOTECH（天津，中國(guó)）。二抗中包含的兔抗和鼠抗購(gòu)自Proteintech（美國(guó)馬薩諸塞州波士頓）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和MTT分析

從吉林大學(xué)購(gòu)買得到鼠腎小管上皮細(xì)胞（mRTEC），在含有10%FBS，100 U×mL-1青霉素，100 U×mL-1鏈霉素和3 mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中于37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此外，mRTEC細(xì)胞（1.2×104個(gè)×孔-1）用香葉木素（10、20和40μM）處理1 h，隨后加入順鉑（20μM）培養(yǎng)24 h。處理后，將細(xì)胞與MTT（5 mg×mL-1）放入CO2培養(yǎng)箱再孵育4 h。然后，除去上清液，并將形成的藍(lán)色甲瓚溶解在DMSO中。在570 nm處測(cè)量光密度，并且將細(xì)胞存活率標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照的百分比。

1.3 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定

將mRTEC接種到96孔板中（1×104個(gè)×孔-1）24 h，并在無(wú)血清DMEM中培養(yǎng)6 h。接下來(lái)，用不同劑量的香葉木素（10、20和40μM）作用24 h，然后向每個(gè)孔中加入順鉑（20μM），作用30 min。然后將細(xì)胞與50 mM DCFH-DA孵育30 min，分別在485和535 nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下評(píng)估熒光強(qiáng)度。

1.4 Hoechst33342染色

將mRTEC接種到12孔板中（5×105個(gè)×孔-1）24 h，然后在順鉑處理前1h用香葉木素（10、20或40μM）處理。取出培養(yǎng)板，每孔加入2μL的hoechst33342溶液，然后CO2培養(yǎng)箱放置15 min。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

將mRTEC接種到6孔板中（1×106個(gè)×孔-1），并在指定的時(shí)間內(nèi)用不同濃度的香葉木素（10、20和40μM）處理并收集。全細(xì)胞裂解液在含有新鮮添加的蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中制備，處理細(xì)胞30 min，隨后在條件為4℃，5 min，8 000轉(zhuǎn)的離心機(jī)中離心，得到的上清液即為所需蛋白。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（中國(guó)，北京）檢測(cè)蛋白濃度。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用5%BSA封閉。然后，洗滌膜并用相應(yīng)的一抗和二抗探測(cè)。蛋白條帶通過(guò)Image Lab得到相應(yīng)結(jié)果。通過(guò)使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照對(duì)蛋白條帶的灰色密度進(jìn)行統(tǒng)一。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

上面引用的所有數(shù)據(jù)均表示為均值±SEM，并使用SPSS19.0（IBM）進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了P值檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)顯著性定義為P*<0.05或P**<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 香葉木素對(duì)順鉑處理的mRTEC活性的影響

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，為了篩選實(shí)驗(yàn)最佳的順鉑濃度，通過(guò)MTT檢測(cè)順鉑在mTEC細(xì)胞中的作用，確定最佳的實(shí)驗(yàn)劑量。結(jié)果表明在順鉑為20μM時(shí)，達(dá)到半數(shù)致死量，我們確定其為建立模型的最佳劑量（圖1 A）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中，確保藥物本身對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的毒副作用是否會(huì)影響實(shí)驗(yàn)是非常重要的一點(diǎn)。為了驗(yàn)證香葉木素的毒性作用，在mTEC細(xì)胞中以不同劑量濃度梯度來(lái)篩選可能的藥物劑量。從結(jié)果可以看出在香葉木素的劑量高于80μM后會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，因此我們將選取的藥物劑量范圍控制在80μM以內(nèi)（圖1 B）。為了篩選順鉑作用之后的mTEC細(xì)胞后香葉木素的最佳劑量，以不同劑量的香葉木素作用于加入了順鉑之后的mTEC細(xì)胞，篩選最佳的香葉木素治療劑量。從結(jié)果可以看出，順鉑使mTEC細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制，而加入香葉木素之后，這種抑制作用得到了緩解，并在40μM之前呈現(xiàn)一個(gè)劑量依賴的增長(zhǎng)。從而我們確定香葉木素的最佳劑量為40μM（圖1 C）。

圖1 香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mRTEC存活率的影響及藥物劑量的篩選Fig.1 Effect of diosmetin on survival rate of mRTECinduced by cisplatin and screening of drug dose

2.2 香葉木素對(duì)順鉑處理的mRTECROS產(chǎn)生的影響

確定了香葉木素及順鉑的計(jì)量之后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性來(lái)看香葉木素對(duì)順鉑造成的細(xì)胞損傷的影響。從結(jié)果可以看到順鉑對(duì)細(xì)胞造成了顯著的損傷，而香葉木素對(duì)這樣的損傷有一個(gè)明顯的抑制作用。隨后，檢測(cè)了香葉木素對(duì)順鉑處理的細(xì)胞的ROS產(chǎn)生的影響。在熒光顯微鏡下觀察到的不同藥物劑量對(duì)加入順鉑后的mTEC細(xì)胞的ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，順鉑組熒光強(qiáng)度較空白對(duì)照組明顯增加，隨著加入的香葉木素劑量的增加，對(duì)于熒光強(qiáng)度的減弱作用也顯著降低了，說(shuō)明香葉木素能夠劑量依賴的抑制順鉑對(duì)mTEC細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生（圖2）。

圖2 香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mRTEC ROS產(chǎn)生的影響Fig.2 Effect of diosmetin on cisplatin-induced mRTECROSproduction

2.3 香葉木素對(duì)順鉑處理的mRTEC細(xì)胞凋亡的影響

ROS的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明氧化應(yīng)激與細(xì)胞的損傷有著密切的聯(lián)系，進(jìn)而進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在加入了順鉑及香葉木素的細(xì)胞培養(yǎng)板中添加Hoechst染料來(lái)檢驗(yàn)細(xì)胞的凋亡狀況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，順鉑組較空白組呈現(xiàn)更多的藍(lán)色熒光。相比加入了香葉木素組，其熒光強(qiáng)度和數(shù)量呈現(xiàn)一個(gè)劑量依賴的遞減（圖3）。由此可以看出香葉木素在抵抗順鉑對(duì)mRTEC的殺傷作用方面起到一個(gè)良好的作用。由此可見香葉木素對(duì)順鉑造成的細(xì)胞凋亡有一個(gè)顯著的抑制作用。

圖3 香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mRTEC細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of diosmetin on mRTECcell apoptosis induced by cisplatin

2.4 香葉木素對(duì)順鉑處理的mRTEC抗氧化通路的影響

為了驗(yàn)證香葉木素通過(guò)Nrf2抗氧化信號(hào)通路對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mTEC細(xì)胞的損傷有抑制作用，通過(guò)提取mRTEC細(xì)胞蛋白，進(jìn)行了Western Blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在細(xì)胞中的Keap-1蛋白在順鉑刺激下表達(dá)量顯著增加了（圖4 A），而Nrf2及下游蛋白HO-1，NQO1的表達(dá)情況一致地呈現(xiàn)劑量依賴的下調(diào)（圖4 B，C和D）。說(shuō)明香葉木素確實(shí)能夠通過(guò)Nrf2抗氧化信號(hào)通路來(lái)緩解順鉑對(duì)mTEC對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

圖4 香葉木素對(duì)順鉑處理的mRTEC抗氧化通路的影響Fig.4 Effect of diosmetin on cisplatin-treated mRTECantioxidant pathway

2.5 香葉木素對(duì)不同癌細(xì)胞的影響

香葉木素可以改善順鉑引起的腎損傷。為了研究香葉木素在順鉑抗癌過(guò)程中的作用，將順鉑和香葉木素與人肺癌細(xì)胞（A549），小鼠T淋巴瘤（OVA），人宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SiHa），人宮頸癌細(xì)胞（Hela）一起使用。結(jié)果顯示香葉木素可以顯著抑制A549，SiHa和OVA細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖5A，B和C），但是對(duì)Hela細(xì)胞的作用不明顯（圖5D）。這表明香葉木素對(duì)不同的癌細(xì)胞具有一定的抗癌作用。

圖5 香葉木素對(duì)不同癌細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of diosmetin on different cancer cells

3 結(jié)論

根據(jù)較早的報(bào)道，順鉑引起的急性腎臟損傷的主要機(jī)制包括氧化應(yīng)激，炎癥和細(xì)胞凋亡。香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mRTEC的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。因此，我們推測(cè)香葉木素可以改善順鉑誘導(dǎo)的腎毒性。結(jié)果表明，香葉木素可顯著改善順鉑誘導(dǎo)的mRTEC的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是一個(gè)過(guò)程，其中外部刺激或自身變化導(dǎo)致人體的ROS增加或ROS清除。已知氧化應(yīng)激是通過(guò)增加ROS促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的重要因素。細(xì)胞內(nèi)ROS水平由抗氧化劑基因嚴(yán)格控制，抗氧化劑基因主要由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)[13]。香葉木素可以減少順鉑誘導(dǎo)的mRTEC中ROS的產(chǎn)生，并改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Nrf2是細(xì)胞抗氧化劑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在正常條件下，Nrf2識(shí)別并與Keap1形成聚合物，而其作用被Keap1抑制。在氧化應(yīng)激和其他條件下，Nrf2和Keap1解離被激活，激活抗氧化反應(yīng)元件（ARE），調(diào)節(jié)II期解毒酶基因和抗氧化酶基因的表達(dá)，并增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激和親電性。對(duì)諸如生物大分子的物質(zhì)具有抗性。因此，調(diào)節(jié)Nrf2激活是預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的有效策略之一[14-16]。據(jù)報(bào)道，天然類黃酮可通過(guò)激活Nrf2途徑誘導(dǎo)保護(hù)性基因的表達(dá)，香葉木素就展現(xiàn)了很好的抗氧化活性[17-18]。

過(guò)量的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致包括細(xì)胞凋亡相關(guān)一系列信號(hào)通路的激活。p53蛋白是DNA損傷的分子傳感器，并且Bcl-2已顯示抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。Bcl-2基因是一種對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用的癌基因，近年來(lái)的一些研究已經(jīng)開始揭示這種作用的機(jī)制。Bcl-2可以與Bcl-2家族的Bcl-2，Bcl-Xs，Bax，Bcl-2，Bad和Mc1-1形成同源蛋白質(zhì)二聚體，而特定的蛋白質(zhì)二聚體可以用作細(xì)胞。死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的分子開關(guān)。例如，Bcl-2與促凋亡Bax形成二聚體[20-21]。如果Bax的相對(duì)量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數(shù)量會(huì)增加，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡。此外，P35蛋白還可以抑制某些半胱天冬酶的功能。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果雖然沒有深入探究凋亡相關(guān)信號(hào)通路揭示香葉木素在順鉑誘導(dǎo)的mRTEC中的作用，但從Hoechst染色結(jié)果以及細(xì)胞存活率等試驗(yàn)的結(jié)果看出細(xì)胞凋亡的重要性。香葉木素可以顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的mRTEC造成的凋亡，具體的機(jī)制還尚待深入研究。

順鉑是臨床上用于治療實(shí)體瘤的最常用化學(xué)治療藥物之一，由于腎毒性的高發(fā)生率，其臨床應(yīng)用受到限制。作為卓越的化療藥物，香葉木素能夠顯著改善順鉑造成的AKI，因此，能否聯(lián)合順鉑和香葉木素治療癌癥成為了關(guān)注點(diǎn)。研究結(jié)果顯示，順鉑對(duì)各種癌細(xì)胞具有殺傷作用，而在香葉木素的聯(lián)合下，其抗癌作用得到了一定的提升，這為臨床上治療癌癥提供了一個(gè)新的思路。

綜上發(fā)現(xiàn)證明了香葉木素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的mRTEC具有保護(hù)作用，這種作用可通過(guò)氧化應(yīng)激和凋亡途徑得到緩解，而炎癥相關(guān)的途徑還有待進(jìn)一步的研究。