李銘銘 岳晨曦 張夢琳 黃文娟 綜述 王瑞濤 審校

癌癥和血栓性并發(fā)癥之間有著密切的聯(lián)系。據(jù)報道，在惡性腫瘤患者中，靜脈血栓栓塞(Venous thromboembolism，VTE)的發(fā)生率為10%～20%，動脈血栓栓塞(Arterial thromboembolism，ATE)的發(fā)生率為1%～4.7%[1-2]。癌癥相關性血栓形成是導致腫瘤患者死亡的第二大原因[3]。

越來越多的證據(jù)表明，血小板活化在癌癥相關性血栓形成中發(fā)揮重要作用。同時，癌細胞誘導的血小板活化還促進了腫瘤的發(fā)展和擴散。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，平均血小板體積和血小板分布寬度與腎細胞癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等腫瘤預后密切相關[4-5]。血小板聚集在腫瘤細胞周圍可保護它們免受剪切力和血液中的自然殺傷細胞的傷害，并為腫瘤細胞提供了與血管壁粘附的支架。此外，活化血小板分泌的血管生成因子和生長因子可促進腫瘤生長和血管生成[6]。腫瘤細胞可通過表達膜蛋白Podoplanin刺激血小板活化。血小板表面C型凝集素樣受體2(C-type lectin-like receptor-2，CLEC2)是Podoplanin的受體。研究證實，Podoplanin和CLEC2之間相互作用，通過活化血小板在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多種生理和病理作用。

1 Podoplanin與CLEC2概述

Podoplanin是血小板受體CLEC2唯一的內(nèi)源性配體[7]。Podoplanin是一種36～43 kD的唾液酸蛋白樣的單跨膜糖蛋白，由一個短的胞內(nèi)結(jié)構域和一個胞外結(jié)構域組成，含有大量的絲氨酸、蘇氨酸殘基作為潛在的O-糖基化位點。Podoplanin具有四個血小板聚集刺激(PLAG)結(jié)構域，這些結(jié)構域具有重復性和高度保守性。其中，PLAG3和PLAG4兩個結(jié)構域均含有谷氨酸、天冬氨酸雙重肽和O-糖基化蘇氨酸，它們是CLEC2和Podoplanin結(jié)合、誘導血小板聚集的重要部位[8]。CLEC2是分子量為32 kDa的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于非經(jīng)典型凝集素樣受體。CLEC2的胞質(zhì)尾部具有半免疫受體酪氨酸基激活基序(hemi-ITAM)，Podoplanin與CLEC2兩者結(jié)合后，該基序通過Src、Syk酪氨酸激酶的磷酸化介導細胞信號轉(zhuǎn)導[9]。Syk通過其兩個Src同源2結(jié)構域識別酪氨酸磷酸化，從而被激活?；罨腟yk相互作用導致磷脂酶Cγ2(PLCγ2)磷酸化和激活，導致細胞內(nèi)鈣水平升高和蛋白激酶C活化，繼而引發(fā)血小板活化[9]。

2 Podoplanin-CLEC2活化血小板參與腫瘤發(fā)生發(fā)展

CLEC2高表達于血小板和巨核細胞，少量由B細胞和髓細胞表達，包括中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞亞群[9]。在惡性腫瘤中，CLEC2與表達Podoplanin的腫瘤細胞相互作用促進腫瘤進展。Podoplanin作為一種淋巴管內(nèi)皮標志物在多種惡性腫瘤中高表達，如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、鼻咽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等[10-14]。Podoplanin的過度表達與腫瘤進展、腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移有關[11，15]。在Podoplanin表達陽性的小鼠腫瘤模型中，抑制Podoplanin表達可減少轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的數(shù)量[16]。此外，Podoplanin在腫瘤內(nèi)的高表達水平與癌癥相關死亡率的增加有關[17]。根據(jù)最近的研究表明，Podoplanin的表達與許多實體腫瘤的更高分級級別和晚期有關[18]。

Podoplanin-CLEC2介導的信號傳導途徑目前仍在探索中。研究證實，Podoplanin胞質(zhì)尾可結(jié)合細胞骨架結(jié)合蛋白(Ezrin-radixin-moesin，ERM)，進而與細胞質(zhì)膜和肌動蛋白絲相互作用，可參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)，促進細胞運動[6]，同時參與促進胚胎發(fā)育和癌癥期間的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[19-20]。此外，Podoplanin-ERM相互作用還參與淋巴管生成和免疫應答[20]，以及通過特殊的細胞表面突起(侵襲性足)募集糖蛋白，促進腫瘤細胞侵襲能力[21]。

2.1 Podoplanin-CLEC2促進腫瘤細胞增殖

Podoplanin-CLEC2與腫瘤細胞增殖密切相關。在口腔不典型增生患者中的研究發(fā)現(xiàn)，Podoplanin表達水平隨著口腔上皮細胞異形程度的增加而增加，猜測Podoplanin表達程度可用于推測發(fā)生口腔癌變的風險[22]。Shirai等[23]報道，血小板與Podoplanin表達陽性的黑色素瘤B16F10細胞共培養(yǎng)，可明顯促進細胞增殖。

2.2 Podoplanin-CLEC2促進腫瘤遠處轉(zhuǎn)移

2.2.1 Podoplanin-CLEC2促進腫瘤血行轉(zhuǎn)移 遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的特征之一，主要包括血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移。Podoplanin通過血小板受體CLEC2誘導血小板聚集，有利于腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移。Xu等[24]為了探討阻斷Podoplanin對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，建立了惡性黑色素瘤異種移植模型。然后從小鼠尾靜脈注射抗Podoplanin封閉抗體SZ168，結(jié)果顯示小鼠黑色素瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移受到明顯抑制。此外，將抗CLEC2抗體2A2B10注射到小鼠體內(nèi)，隨后注射表達Podoplanin的黑色素瘤細胞系B16F10，結(jié)果顯示可顯著抑制肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量[23]。以上結(jié)果提示Podoplanin與CLEC2相互作用，有助于循環(huán)腫瘤細胞在血流中的存活和/或粘附。

2.2.2 Podoplanin-CLEC2促進腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移 Podoplanin-CLEC2在淋巴管發(fā)育中起著重要的作用，還可促進腫瘤細胞淋巴道轉(zhuǎn)移[25]。最新研究發(fā)現(xiàn)，相比于脂溢性皮炎而言，Podoplanin在非黑色素瘤皮膚癌(包括基底細胞癌和鱗狀細胞癌)中的表達水平明顯上調(diào)。其在非黑色素瘤皮膚癌中的表達水平與淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量呈正相關[26]。比利時癌癥中心的研究表明，抑制Podoplanin表達可降低小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移，認為Podoplanin可作為乳腺癌患者潛在的預后指標[25]。同樣在肺鱗癌中研究證實，Podoplanin表達水平與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后不良有顯著相關性[27]。然而，Podoplanin在宮頸癌中的作用是獨特的。研究證實，相比于對照組，Podoplanin陽性表達的宮頸癌患者存活率更高[12]。以上結(jié)果表明，Podoplanin有望成為評估部分惡性腫瘤預后的獨立預測因子，其有望成為腫瘤治療的新靶點。

2.3 Podoplanin-CLEC2促進癌癥相關血栓形成

Podoplanin-CLEC2誘導的血小板聚集作用可能并不局限于腫瘤惡性進展。K?nigsbrügge等[28]應用前瞻性的“維也納癌癥和血栓形成研究(CATS)”隊列，對200多名原發(fā)性腦腫瘤患者(大部分為高級別膠質(zhì)瘤)進行隨訪研究。研究的主要終點是VTE的發(fā)生，目的是確定惡性腫瘤患者發(fā)生高VTE風險。結(jié)果顯示，約14%的原發(fā)性腦腫瘤患者出現(xiàn)了客觀證實的VTE。Riedl等[17]用免疫組化方法對腦瘤標本中Podoplanin的表達水平和血小板聚集情況進行研究。結(jié)果顯示Podoplanin的過度表達與腫瘤內(nèi)血栓形成和VTE風險的增加密切相關。此外，表達Podoplanin的腦瘤患者血小板計數(shù)降低，血漿D-二聚體水平升高。這些數(shù)據(jù)表明Podoplanin上調(diào)可能誘發(fā)患者血液高凝狀態(tài)，從而可能觸發(fā)VTE。Podoplanin-CLEC2相互作用在癌癥相關血栓形成中起著重要作用。

Shirai等[23]在荷瘤小鼠模型中觀察到，接種了Podoplanin陽性的B16F10細胞后，小鼠的背部皮膚中有大量血栓形成。抑制CLEC2表達后，小鼠血栓形成受到極大抑制，表明Podoplanin-CLEC2相互作用可刺激血小板活化，導致血栓形成。然而，由于Podoplanin也在正常組織中表達(包括腎足細胞、Ⅰ型肺泡細胞、淋巴管內(nèi)皮細胞)，導致癌癥相關血栓形成的Podoplanin可能并不局限于腫瘤細胞表面[29]。雖然這些細胞中的Podoplanin不能獲得血小板CLEC2，然而，在病理狀態(tài)下，可誘導異位Podoplanin表達。Payne等[30]報道了在靜脈血栓形成過程中，Podoplanin在血管壁的表達上調(diào)，這可能是由血栓炎癥引起的。此外，據(jù)報道，癌相關成纖維細胞表達Podoplanin，這與肺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌的惡性程度和不良預后相關[6]。這種病理表達的Podoplanin也可能通過與血小板CLEC2的相互作用參與癌相關血栓形成。

3 靶向Podoplanin-CLEC2在腫瘤治療中的作用

3.1 抗血小板藥物存在出血風險

由于Podoplanin-CLEC2活化血小板，在癌癥相關血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制血小板可能成為有效靶點。血小板活化和聚集涉及多種機制，臨床上常用的抗血小板藥物是二磷酸腺苷P2Y12受體阻斷劑，如氯吡格雷、普拉格雷。血小板活性也可通過抑制環(huán)氧化酶(如阿司匹林)或血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體(如阿昔單抗或替羅非班)而受到影響。先前的研究表明，阿司匹林在體外能夠降低Podoplanin介導的血小板聚集[31]。根據(jù)血小板聚集增加癌癥相關血栓形成的風險，ASCO指南推薦，低劑量阿司匹林或抗凝劑(如低分子肝素)可用于多發(fā)性骨髓瘤患者的一級血栓預防[32]。然而，與抗凝劑類似，阿司匹林和其他抗血小板藥物也有出血的風險，這限制了它們的臨床應用[33]。

3.2 CLEC2和Podoplanin作為藥物靶點

阻斷CLEC2和Podoplanin的靶向藥物在臨床前研究中已顯示出作為抗癌藥物的前景。理論上，這些藥物可以減少腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、癌相關血栓形成。

人Podoplanin與CLEC2的結(jié)合依賴于其本身的PLAG3和PLAG4結(jié)構域。在此過程中，PLAG4結(jié)構域起主導作用?？筆odoplanin靶向藥物正是根據(jù)這一原理研制，它能夠識別Podoplanin的PLAG3或PLAG4的部分區(qū)域，以發(fā)揮效應[34]。研究證實，識別Podoplanin的PLAG3的單克隆抗體NZ-1對Podoplanin-CLEC2活化血小板具有抑制作用[35]。此結(jié)果在其他Podoplanin單抗(如P2-0和MS-1)也得到驗證[34，36]。研究還發(fā)現(xiàn)Podoplanin表達被抑制后，血栓體積會明顯縮小[30]。此外，在小鼠模型中研究證實，Podoplanin單抗與其他治療手段聯(lián)合治療，能增強抗腫瘤療效。Podoplanin單抗NZ-12和培美曲塞聯(lián)合在治療小鼠惡性胸膜間皮瘤中效果顯著[37]。NZ-1聯(lián)合近紅外光免疫療法，對惡性胸膜間皮瘤有顯著的抗腫瘤作用[38]。大鼠-人嵌合抗體NZ-12可用于惡性胸膜間皮瘤放射免疫治療，增強抗腫瘤作用[39]。這些證據(jù)有力地表明Podoplanin單抗具有良好的臨床應用前景。然而，由于Podoplanin在正常組織中也有表達[29]，應注意其潛在的藥物不良反應。為了解決這個問題，已經(jīng)報道了特異性識別癌細胞上異常糖基化Podoplanin的LpMab單克隆抗體系列[40]。盡管該抗體很有希望避免副作用，但它可能無法識別慢性炎癥期間內(nèi)皮細胞、單核細胞中Podoplanin上調(diào)，會參與癌癥相關的血栓形成。

研究還證實，CLEC2缺乏的小鼠在不增加出血的情況下發(fā)生VTE的風險顯著降低[37]。且CLEC2缺乏的小鼠出血時間并無明顯延長[41-42]。這表明血小板受體CLEC2在生理止血中的作用較小。同時考慮到CLEC2的表達高度局限于血小板和巨核細胞，故靶向CLEC2治療可能具有優(yōu)勢。迄今為止，抗CLEC2抗體[23]、CLEC2結(jié)合小分子[43]和突變重組紅細胞素[44]已被報道可與CLEC2結(jié)合，并阻止CLEC2與Podoplanin結(jié)合。但臨床應用前仍需進一步研究。這些新的見解為癌癥相關血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移的治療和預防提供了新的策略。

4 小結(jié)與展望

部分癌細胞在其表面表達不同的Podoplanin。Podoplanin通過結(jié)合血小板受體CLEC2活化血小板，與腫瘤惡性進展、癌癥相關血栓形成及預后不良有關?；谶@些發(fā)現(xiàn)，Podoplanin和CLEC2可能是惡性腫瘤治療的有吸引力的藥物靶點。然而，Podoplanin在正常組織中廣泛表達[29]。因此，需要進一步的研究來探索Podoplanin及CLEC2靶向藥物在體內(nèi)的潛在毒性和優(yōu)勢。