周凡茹 宋玙璠 張 楚 劉 霞 李 凡 胡茹楠 黃燕靖 張明敏

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院1中西醫(yī)結(jié)合研究所，2中醫(yī)科，武漢 430030

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指各種原因?qū)е碌呐?0歲以前卵巢功能病理性下降，并伴有閉經(jīng)、性腺功能減退和不孕癥等疾病，嚴(yán)重影響女性生殖健康。據(jù)統(tǒng)計[1]，POF在30歲以下女性中的發(fā)病率約為0.1%，在40歲以下女性中的發(fā)病率為1%，其病因包括染色體異常、自身免疫因素、環(huán)境因素、心理因素和醫(yī)源性因素等。目前治療POF的方法主要包括激素治療、卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存、卵巢組織移植和干細(xì)胞移植等，然而這些治療方法往往存在不同程度的治療局限性、操作侵襲性、質(zhì)量不可控性，甚至可能產(chǎn)生同種異體移植的免疫反應(yīng)，并且常常涉及倫理問題等[2]。外泌體為細(xì)胞產(chǎn)生的直徑在30～100 nm的囊泡，是細(xì)胞間信號傳遞及藥物治療的載體，在腫瘤、免疫、心血管等領(lǐng)域已有深入研究，但在卵巢疾病尤其是POF方面的研究目前仍較為有限。微小RNA(microRNA，miRNA)是外泌體攜帶的主要功能因子，其在卵巢早衰的發(fā)生及治療中具有重要意義。鑒于此，本文總結(jié)了目前外泌體miRNA在POF治療中的研究現(xiàn)狀，以期為POF的治療提供新的思路和方法。

1 外泌體的形成與作用

1.1 外泌體的形成

在最近幾年的研究中，出現(xiàn)了新的細(xì)胞間相互通信的機制，即細(xì)胞外囊泡。細(xì)胞外囊泡是通過細(xì)胞脂質(zhì)雙層向內(nèi)萌芽收縮，形成細(xì)胞內(nèi)的多囊泡體，與細(xì)胞膜結(jié)合以鈣依賴性方式釋放到細(xì)胞外環(huán)境中形成的納米級囊泡[3]。細(xì)胞能夠產(chǎn)生和釋放不同類型的囊泡，例如微泡、外泌體、凋亡小體和外在體，它們的大小、生物發(fā)生和表面標(biāo)志物都不同[4]。外泌體是細(xì)胞間通信的重要介質(zhì)，攜帶多種生物活性細(xì)胞因子，包括生長因子、脂質(zhì)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和miRNA等[5-6]。幾乎所有的細(xì)胞均能夠產(chǎn)生外泌體，并且在體液中也有大量存在，例如血液、唾液、尿液、母乳、羊水中，還可從腹腔積液、卵泡液中分離得出[7]。不同細(xì)胞來源的外泌體所含RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)均有所差異，功能也不盡相同[8]。

1.2 外泌體的作用

外泌體在細(xì)胞間發(fā)揮重要的通信作用[9]，并具有多種屬性，例如轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)、非水溶性分子等，并具有膜穿透能力、載藥能力和長循環(huán)半衰期等[10]。基于外泌體產(chǎn)生細(xì)胞的生理環(huán)境變化，外泌體的數(shù)量及特征亦可發(fā)生變化[11]。這些特性給外泌體的應(yīng)用帶來了一定的穩(wěn)定性及可變性，一方面外泌體能夠繼承其產(chǎn)生細(xì)胞的一定生物學(xué)特征；另一方面，根據(jù)所產(chǎn)生細(xì)胞的環(huán)境變化，外泌體攜帶的生物學(xué)特性也會發(fā)生部分改變。此外，有研究表明，外泌體具有較長的循環(huán)半衰期，無免疫原性[12]，具有較高溶解度和生物利用度[13]，能夠耐受低pH值[14]和高溫環(huán)境，這些屬性對于將外泌體用作藥物輸送載體是十分重要的。

外泌體在正常生理狀態(tài)下廣泛參與組織再生、免疫監(jiān)視、血液循環(huán)和干細(xì)胞重塑等過程[15]，并且在疾病發(fā)病機理中也具有關(guān)鍵作用。外泌體復(fù)雜的生物發(fā)生及生物學(xué)特征反映了親代細(xì)胞內(nèi)部的分子加工過程，最適合用作體液中該親代細(xì)胞的潛在替代物[16]，因此廣泛用于臨床診斷和治療開發(fā)。

目前的研究[17-18]結(jié)果顯示，外泌體主要通過3種可能機制參與細(xì)胞通信并發(fā)揮作用：第一，外泌體的膜蛋白可以與靶細(xì)胞中的受體相互作用并激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；第二，外泌體膜蛋白的裂解片段可以作為配體，與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而激活靶細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)；第三，外泌體與靶細(xì)胞膜融合，以非選擇性方式釋放其內(nèi)含物，從而導(dǎo)致信號傳導(dǎo)的激活。

1.3 外泌體miRNA的作用

在外泌體運載的生物分子中，miRNA的作用受到越來越多的關(guān)注，miRNA是長度約為20～24個核苷酸的非編碼RNA，這些小分子與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，可以導(dǎo)致翻譯的抑制和/或mRNA降解，異常的miRNA表達(dá)與多種人類疾病有關(guān)，例如癌癥、心血管疾病、炎性疾病和婦科疾病[19]。生殖系統(tǒng)中miRNA的表達(dá)水平與女性的生育能力以及胚胎發(fā)育能力密切相關(guān)[20]。miRNA通過轉(zhuǎn)錄抑制或降解來調(diào)控基因表達(dá)，在卵母細(xì)胞成熟和卵泡形成過程中發(fā)揮重要作用[21]。

2 外泌體miRNA對卵巢早衰不同環(huán)節(jié)的調(diào)控

卵巢卵泡是一個由內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌信號精密調(diào)控的相對獨立單位，卵巢卵泡的生長和成熟過程涉及廣泛的細(xì)胞間通信，包括體細(xì)胞(卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞)間、體細(xì)胞與卵母細(xì)胞間。研究者[22]對卵泡中的主要成分卵泡液進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)其富含多種來源的外泌體，并且在介導(dǎo)哺乳動物卵泡內(nèi)的細(xì)胞通信中起著前所未有的作用。

2.1 外泌體miRNA與顆粒細(xì)胞功能

顆粒細(xì)胞是卵泡主要的細(xì)胞類型，它們支持卵泡的形成和發(fā)育，并具有分泌促性腺激素以維持卵巢功能的作用，是維持卵泡正常發(fā)育的關(guān)鍵。卵泡閉鎖是POF的一個重要特征，主要是由卵泡細(xì)胞的凋亡，尤其是顆粒細(xì)胞的凋亡引起的[23]。

多個研究結(jié)果表明，外泌體可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)途徑來改善卵巢功能。Yang等[24]通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)來源的外泌體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其攜帶的miR-144-5p能夠靶向抑制第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，從而上調(diào)PI3K/AKT通路來促進(jìn)化療后的卵巢卵泡恢復(fù)。Santonocito等[25]研究也顯示，在卵泡液來源的外泌體中，高表達(dá)的miR132、miR212、miR214能夠靶向PTEN沉默，從而激活A(yù)KT打開PI3K信號傳導(dǎo)途徑。

Huang等[26]研究結(jié)果顯示人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells，HAMSCs)來源的外泌體可通過激活SMAD通路來抑制Fas/FasL、caspase-3和caspase-8的表達(dá)，并且可以在體內(nèi)和體外增加SMAD2、SMAD3和SMAD5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，改善卵巢功能不全小鼠的卵巢功能。

在一項順鉑誘導(dǎo)POF的實驗[27]中發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)來源的外泌體可顯著上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)凋亡蛋白c-caspase-3的表達(dá)，表明HUMSCs來源的外泌體對順鉑誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡亦具有保護作用。該研究者還對HUMSCs來源的外泌體攜帶的miRNA進(jìn)行了實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)陣列分析，并預(yù)測miRNA-24、miRNA-106a、miRNA-19b和miRNA-25可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在另一項研究中，Sang等[28]鑒定出存在于微泡和人卵泡液上清液中的miRNA-24能調(diào)節(jié)雌二醇濃度和孕酮濃度，這表明高表達(dá)的miRNA-24可靶向于生殖、內(nèi)分泌和代謝過程中相關(guān)基因。外泌體對于卵巢顆粒細(xì)胞類固醇合成的調(diào)節(jié)作用在Vashisht等[29]研究中也有印證，其結(jié)果表明從姜黃素處理過的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中提取的外泌體能夠阻止水牛顆粒細(xì)胞中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)抑制的Cyp19A1表達(dá)和17β-雌二醇生成。

基于上述研究，我們發(fā)現(xiàn)外泌體對于卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個方面，即顆粒細(xì)胞自身的增殖凋亡和顆粒細(xì)胞的類固醇合成功能。其調(diào)控的差異可能受到外泌體來源的影響，并根據(jù)其攜帶的不同miRNA而產(chǎn)生不同的調(diào)控作用。

2.2 外泌體miRNA與卵巢血管形成

血管形成是女性生殖系統(tǒng)正常運作和成功實現(xiàn)妊娠的重要過程[30]。卵巢功能取決于復(fù)雜血管系統(tǒng)的建立和持續(xù)重塑，正常的血管網(wǎng)絡(luò)是供給卵泡和黃體充足氧氣、營養(yǎng)和激素的必要條件[31]，因此，血管形成對于卵泡發(fā)育、優(yōu)勢化及排卵至關(guān)重要。

血管生成是涉及血管形成細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境之間相互作用的復(fù)雜生物過程，而miRNA是內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，尤其是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[32]。目前，外泌體對于血管形成相關(guān)調(diào)控機制已有深入研究。在一項將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)進(jìn)行體外培養(yǎng)的實驗中，Gong等[33]驗證了間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)的條件培養(yǎng)基具有促血管生成能力，并發(fā)現(xiàn)MSC衍生的外泌體能夠攜帶各種促血管生成相關(guān)的miRNA，并將這些miRNA轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)血管生成；外泌體攜帶的miR-30b可能通過抑制DLL4表達(dá)，從而在MSC介導(dǎo)的血管生成中起重要作用。類似的結(jié)果在Liang等[34]的研究中也被發(fā)現(xiàn)，他們的研究結(jié)果表明，HAMSCs來源的外泌體在體外和體內(nèi)均可增強內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，其富含的miR-125a可轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞中，并通過直接抑制DLL4來促進(jìn)尖端細(xì)胞的特異性。此外，Zhang等[35]在對人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)來源的外泌體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其能夠抑制化療誘導(dǎo)POF模型中的急性血管損傷，從而保護卵巢血管免受損害。

外泌體對于血管形成的調(diào)控作用還可能會受到外泌體產(chǎn)生環(huán)境的影響。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病模型心肌細(xì)胞的外泌體和健康心肌細(xì)胞的外泌體均包含促血管生成的miR-126和抗血管生成的miR-320，但其中包含的miRNA數(shù)量卻有所不同，健康心肌細(xì)胞組的外泌體比2型糖尿病模型組的外泌體具有更高水平的miR-126和更低水平的miR-320，這可能部分導(dǎo)致了2組中完全相反的血管形成作用。這個結(jié)果提示，外泌體miRNA/蛋白質(zhì)的組成可以是動態(tài)變化的，并取決于細(xì)胞/組織的生理/病理狀況。

2.3 外泌體miRNA與卵巢微環(huán)境

氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞衰老的主要原因之一，暴露于有毒物質(zhì)和電離輻射均可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[37-38]。氧化應(yīng)激在POF發(fā)病機理中的作用雖未得到深入研究，但已有結(jié)果[39]顯示卵巢氧化應(yīng)激是原始卵泡加速衰竭的原因。

研究[40]表明，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)作為氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在保護生物體免受各種氧化劑及有毒物質(zhì)損傷中起著重要作用。Kahroba等[41]發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的Nrf2及其介導(dǎo)產(chǎn)物可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞抗氧化水平，從而誘導(dǎo)組織修復(fù)和再生。在一項用過氧化氫培養(yǎng)顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激實驗中，Saeed-Zidane等[42]發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞來源的外泌體含有Nrf2 mRNA，該mRNA可激活其他細(xì)胞特別是卵母細(xì)胞中的抗氧化信號通路，從而抵抗氧化應(yīng)激環(huán)境。此外，人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，HESCs)衍生的外泌體能夠恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老及其增殖遷移和血管形成能力，這種機制可能是通過miR-200a在HESCs衍生的外泌體中高度富集，并下調(diào)負(fù)調(diào)控Nrf2表達(dá)的Keap1，從而在其介導(dǎo)的血管再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[43]。

Ding等[44-45]研究揭示了HAECs來源的外泌體miR-320a和HUMSCs來源的外泌體miRNA-17-5p，分別能夠靶向下調(diào)SIRT4和SIRT7及下游相關(guān)基因表達(dá)水平，從而降低卵巢內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，減少細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞衰老的發(fā)生。靶向ROS產(chǎn)生和誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)是克服衰老的前景治療策略，外泌體miRNA在其中的作用仍有很多未知途徑，仍待進(jìn)一步研究證實。

3 研究展望

迄今為止，外泌體在生殖系統(tǒng)疾病中的研究越來越受到重視，外泌體miRNA作為細(xì)胞間信號傳遞的重要物質(zhì)及潛在治療靶點，對卵巢顆粒細(xì)胞、血管形成和抗氧化微環(huán)境調(diào)節(jié)具有重要作用。經(jīng)過文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA的作用主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面，正常組織中不同來源的外泌體miRNA可以直接發(fā)揮功能特異的調(diào)控作用；另一方面，藥物干預(yù)能夠改變外泌體miRNA的數(shù)量和特性，從而改變其功能，這也是外泌體作為藥物載體的一項重要應(yīng)用。在未來的研究中，仍需進(jìn)一步深入探討靶向外泌體miRNA治療的開發(fā)和應(yīng)用，以期為卵巢早衰治療提供更安全有效的方法。