曹夢(mèng)麗 宋仁德 李吉葉 郭憲*

（1，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 730050；2，青海省玉樹(shù)州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 815000；3，青海省大通種牛場(chǎng) 810102）

牦牛（Bos Grunniens）屬于哺乳綱偶蹄目?？婆?，是青藏高原及其毗鄰地區(qū)的主導(dǎo)牛種，其抗逆性強(qiáng)，能極好的適應(yīng)高原的惡劣環(huán)境?？蔀楫?dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、奶、毛、役力、燃料等生活必需品，是高寒地區(qū)畜牧經(jīng)濟(jì)中寶貴的遺傳資源，具有不可替代的地位，被譽(yù)為“高原之舟”[1]。犏牛是牦牛與黃牛的雜交后代，具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)[2]，既對(duì)高海拔、低氣壓、低溫等惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)適應(yīng)性，又能適應(yīng)海拔較低、氣溫較高的地區(qū)，同時(shí)乳、肉生產(chǎn)能力、役用能力均優(yōu)于牦牛。但由于物種間存在生殖隔離，使得犏牛雄性不育，極大阻礙了犏牛優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，所以，研究其不育機(jī)理具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前，關(guān)于牦牛、犏牛睪丸組織的相關(guān)研究已成為牦牛改良和提高牦牛種用性能的研究熱點(diǎn)，本文對(duì)近8 年來(lái)關(guān)于牦牛與犏牛睪丸組織轉(zhuǎn)錄組及蛋白組的比較研究進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在為提高牦牛種用性能和犏牛雄性不育研究提供基礎(chǔ)資料。

1 轉(zhuǎn)錄組比較研究

1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要研究方法

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指生物體某一生理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因的總和，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，基因的結(jié)構(gòu)和功能可在整體水平上進(jìn)行研究以發(fā)現(xiàn)所涉及的特定生物學(xué)過(guò)程。隨著組學(xué)的快速發(fā)展，基因芯片技術(shù)、基因表達(dá)序列分析技術(shù)及大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)等轉(zhuǎn)錄組研究方法已被轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)替代。以Sanger 測(cè)序法為代表的笫一代測(cè)序技術(shù)主要特點(diǎn)是準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%，但讀長(zhǎng)（Reads）長(zhǎng)度僅為700～900bp，設(shè)備運(yùn)行時(shí)間短，適用于通量要求低的快速研究項(xiàng)目，一個(gè)反映僅能得到一條讀長(zhǎng)，且大規(guī)模測(cè)序成本較高，一般適用于少量樣本的小規(guī)模測(cè)序[3]；第二代測(cè)序技術(shù)主要有Roche 公司的454 技術(shù)、illumina 公司的Solexa 技術(shù)和ABI 公司的SOLID 技術(shù)，為高通量測(cè)序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測(cè)序，讀長(zhǎng)短，但reads 數(shù)量巨大，適合用作表達(dá)定量，且單條序列成本非常低廉，適用于大規(guī)模高通量的測(cè)序需求，現(xiàn)在仍是科研市場(chǎng)的主力平臺(tái)[3]；第三代測(cè)序技術(shù)以PacBio 公司的SMRT 和Oxford Nanopore Technologies 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)主流，該技術(shù)能在單核苷酸水平上檢測(cè)物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，并且可以識(shí)別和量化剪接類(lèi)型并進(jìn)行堿基修飾檢測(cè)，具有操作步驟簡(jiǎn)單、通量高，成本低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。RNA-seq 可直接分析生物體的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，也可用于未知的基因組序列分析，得到廣泛應(yīng)用。近年研究人員通過(guò)RNA-seq 比較牦牛與犏牛睪丸組織轉(zhuǎn)錄組差異，為更好地了解犏牛生精障礙的原因，為揭示犏牛雄性不育機(jī)理提供了基礎(chǔ)信息。

1.2 在牦牛犏牛科學(xué)研究中的應(yīng)用

1.2.1 編碼RNA

曾賢斌[4]采集牦牛和犏牛（各5 頭）個(gè)體的睪丸組織，制成2 組睪丸組織混合樣，用RNA-Seq 測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和比較分析，研究表明，牦牛、犏牛睪丸中分別有18529 和17784 個(gè)基因表達(dá)，犏牛睪丸組織中表達(dá)顯著上調(diào)基因有5000個(gè)，顯著下調(diào)基因有4089 個(gè)；其睪酮合成的相關(guān)基因和抑制素基因表達(dá)均顯著上調(diào)；與性染色體間的聯(lián)會(huì)復(fù)合體數(shù)量有關(guān)的Syce3、Fkbp6、Dmrt7 等基因表達(dá)極顯著下調(diào)，參與雙鏈斷裂和同源修復(fù)過(guò)程的Spo11、Dmc1 基因表達(dá)下調(diào)，參與高度濃縮細(xì)胞核的相關(guān)基因，尤其是Tnp2、Hmgb4 和H1fnt 等幾乎不表達(dá)，調(diào)控基因Crem、GRTH/DDX25 等極顯著下調(diào)表達(dá)；p53、TNF-α、Trail、Bmp8b、Bax、Caspase-3、Caspase-6 和Caspase-7 等凋亡相關(guān)基因表達(dá)均顯著上調(diào)，而抑凋亡基因survivin、Bcl-2 等顯著下調(diào)。由此可見(jiàn)，犏牛睪丸組織中的高表達(dá)基因大多參與蛋白合成及細(xì)胞凋亡活動(dòng)，而參與精子生成的基因低表達(dá)或不表達(dá)。

楊芳[5]基于RNA-Seq 技術(shù)對(duì)12 月齡的牦牛和犏牛（各3頭）個(gè)體的2 份睪丸組織樣進(jìn)行測(cè)序和比較分析，結(jié)果顯示：共得到2960 個(gè)差異表達(dá)基因，犏牛睪丸組織樣中679 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2281 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；GO 富集分析差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)了與精子發(fā)生相關(guān)的大量基因下調(diào)，與減數(shù)分裂相關(guān)基因CDKN2C、CYP26A1、OVOL1、GGN、MAK、INSL6、RNF212、TSSK1B、TSSK2、TSSK6 下調(diào)使減數(shù)分裂過(guò)程中精子發(fā)生阻滯加劇，與精子結(jié)構(gòu)組分相關(guān)基因PRM2、ODF3 下調(diào)，導(dǎo)致精子形態(tài)異常；PATHWAY 富集分析差異表達(dá)基因Wnt/β-catenin 參與的信號(hào)通路中Wnt3a、PP2A、TCF/LEF-1 等基因的下調(diào)導(dǎo)致犏牛精原干細(xì)胞分化受阻。該研究從精原干細(xì)胞分化、精子發(fā)生及精子形態(tài)結(jié)構(gòu)方面闡明犏牛雄性不育的機(jī)制。

Wu 等[6]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)12 月齡牦牛和犏牛（各3頭）個(gè)體睪丸組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，共鑒定出差異表達(dá)6477 個(gè)，其中2919 個(gè)上調(diào)，3558 個(gè)下調(diào)，大多數(shù)差異表達(dá)基因與有絲分裂和細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)，參與膠原纖維組裝、細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的基因上調(diào)可能阻礙了精細(xì)胞從基底部向管腔的移動(dòng)。

上述研究探究了牦牛、犏牛睪丸組織編碼RNA 表達(dá)差異，對(duì)與激素調(diào)節(jié)、精子發(fā)生、精原細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因進(jìn)行了分析，通過(guò)相關(guān)分析得出犏牛精子發(fā)生阻滯開(kāi)始于精原細(xì)胞分化階段，減數(shù)分裂階段加強(qiáng)，精細(xì)胞在移動(dòng)中受阻，后期精子形態(tài)及結(jié)構(gòu)異常。為揭示犏牛雄性不育機(jī)理提供了基礎(chǔ)資料。

1.2.2 非編碼RNA

廖珂[7]采集牦牛、普通牛和犏牛（各3 頭）成年個(gè)體的睪丸組織構(gòu)建miRNA 文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序，結(jié)果表明，3 個(gè)文庫(kù)中共有580 個(gè)miRNA，三者均表達(dá)的有439 個(gè)，牦牛、普通牛、犏牛差異表達(dá)分別是9、10、69 個(gè)；犏牛與牦牛文庫(kù)相比，表達(dá)極顯著上調(diào)和下調(diào)的分別有312 個(gè)、11 個(gè)，與普通牛文庫(kù)相比，表達(dá)極顯著上調(diào)和下調(diào)分別是321 個(gè)、8 個(gè)；犏牛睪丸組織中表達(dá)量較高的miRNA（bat-miR-125a、bat-miR-125b、bat-miR-26a、bat-miR-26b）調(diào)控靶基因涉及細(xì)胞凋亡機(jī)制，可能與其精子發(fā)生阻滯相關(guān)；差異表達(dá)miRNA 的靶基因主要參與了4 種富集通路，分別是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、促性腺激素釋放激素受體通路、Wnt 信號(hào)通路以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 信號(hào)通路。

徐傳飛[8]通過(guò)比較分析12 月齡的牦牛和犏牛（各3 頭）個(gè)體的睪丸組織miRNA 文庫(kù)的差異發(fā)現(xiàn)了已知的50 個(gè)miRNA差異表達(dá)顯著，上調(diào)和下調(diào)分別是11 個(gè)、39 個(gè)、11 個(gè)新的miRNA 差異表達(dá)顯著，上調(diào)和下調(diào)分別是8 個(gè)、3 個(gè)，其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378 和miR-184 參與精原干細(xì)胞自我更新及分化過(guò)程，miR-34c、miR-449a 參與減數(shù)分裂起始過(guò)程；確定了13 個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA 的50個(gè)假定靶標(biāo)和6 個(gè)差異表達(dá)的新miRNA 的30 個(gè)假定靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA 靶基因主要富集通路是G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路及核糖體結(jié)構(gòu)成分。

Wang 等[9]等利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牦牛、普通牛和犏牛各3 頭成年個(gè)體睪丸組織的miRNAs 和piRNAs 進(jìn)行了分析，得到普通牛和犏牛、普通牛、牦牛以及牦牛和犏牛的差異表達(dá)miRNA 分別為119 個(gè)、14 個(gè)、6 個(gè)，差異表達(dá)piRNA 分別是873 個(gè)、1065 個(gè)、1158 個(gè)，提示在犏牛中非編碼RNA 的表達(dá)調(diào)控可能與其精子發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。

伍仕鑫[10]對(duì)（12±1）月齡的牦牛和犏牛各3 頭個(gè)體的睪丸組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出604 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，在犏牛睪丸組織中顯著性高表達(dá)和低表達(dá)分別是135 個(gè)、469個(gè)；差異表達(dá)lncRNA 的靶基因主要參與犏牛生精分裂的起始、細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA 復(fù)制、同源重組、細(xì)胞內(nèi)吞、生長(zhǎng)、分化及凋亡等信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程，其中PCNA、PPP2R5C、CDK1、BRCA1、RPA2、CLSPN、CCNB1、TEX14 和CDC45 等大量靶基因參與有絲分裂細(xì)胞進(jìn)程，在犏牛中下調(diào)表達(dá)。

阿果約達(dá)等[11]等采用RNA-Seq 測(cè)序技術(shù)對(duì)3～4 歲的牦牛（3 頭）和犏牛（3 頭）的睪丸組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明，分別得牦牛、犏牛lncRNA 轉(zhuǎn)錄本20363 個(gè)、24133 個(gè)，篩選出6178 個(gè)顯著差異lncRNA，與牦牛相比，犏牛睪丸組織上調(diào)和下調(diào)分別是2470 個(gè)、3708 個(gè)；篩選得到差異顯著lncRNA 的候選靶基因2676 個(gè)，主要富集通路包括軸突指導(dǎo)、內(nèi)吞、Hedgehog 等信號(hào)通路，一些lncRNA 介導(dǎo)的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11與犏牛雄性不育有關(guān)。

上述研究篩選出了牦牛、普通牛和犏牛睪丸組織的差異非編碼RNA，并對(duì)其靶基因進(jìn)行通路和基因富集分析，這些靶基因主要涉及DNA 復(fù)制過(guò)程損傷的檢測(cè)及修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控、細(xì)胞黏附、遷移、免疫、代謝等信號(hào)通路，并具有核酸、蛋白質(zhì)結(jié)合功能，表明這些非編碼RNA 可調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞分化、精子形成及精細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程。這些研究為更好地了解犏牛生精障礙的原因，揭示犏牛雄性不育機(jī)理提供了基礎(chǔ)信息。

2 蛋白組比較研究

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究方法

蛋白組學(xué)研究方法主要包括蛋白質(zhì)分離、定量、鑒定。分離技術(shù)主要有雙向凝膠電泳、雙向熒光差異電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)吸管電泳、高效液相色譜和二維液相色譜等；定量技術(shù)主要有蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（Label Free）、相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）等，鑒定技術(shù)主要有肽質(zhì)量指紋圖譜等，酵母雙雜交技術(shù)用于鑒定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。定量蛋白質(zhì)組是把一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白或者是一個(gè)復(fù)雜體系所有的全部蛋白進(jìn)行鑒定和定量的方法。其中Label Free 用于分析不同組織或細(xì)胞之間的蛋白相對(duì)差異，i-TRAQ 利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N 末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較8 種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法已應(yīng)用于牦牛犏牛比較科學(xué)研究中。

2.2 在牦牛犏牛科學(xué)研究上的應(yīng)用

付偉等[12]等采集健康成年牦牛(n=4)、犏牛(n=2) 的睪丸組織，應(yīng)用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)牦牛和犏牛的睪丸組織中差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，共獲得差異蛋白19 個(gè)，其中表達(dá)量相當(dāng)?shù)牡鞍? 個(gè)，與牦牛相比犏牛睪丸組織13 個(gè)差異蛋白低表達(dá)，4 個(gè)差異蛋白上調(diào)；發(fā)現(xiàn)T-復(fù)合蛋白、肽酰脯氨順-反異構(gòu)酶D、鐵蛋白均有分子伴侶活性，且在犏牛睪丸組織中表達(dá)偏低，山梨醇脫氫酶是多元醇代謝通路的關(guān)鍵酶，該通路是精子獲能的重要來(lái)源，在犏牛中低表達(dá)可能與雄性不育有關(guān)。

屈兵兵等[13]提取健康成年牦牛（n=9）、犏牛(n=7) 睪丸組織總蛋白，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用Westernblot 技術(shù)檢測(cè)影響生殖活動(dòng)的磷酸酶甲酯酶-1 (PPME1）在牦牛和犏牛睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表明，PPME1 在犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平顯著低于牦牛，相差約14 倍，說(shuō)明PPME1 在犏牛睪丸中的低表達(dá)可能與其雄性不育存在關(guān)聯(lián)。

Yu 等[14]采集12 月齡的牦牛和犏牛（各3 頭）的睪丸組織，應(yīng)用iTRAQ 法對(duì)其蛋白組進(jìn)行比較研究，共鑒定出顯著差異表達(dá)蛋白256 個(gè)，與牦牛相比，犏牛睪丸組織88 個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，168 蛋白表達(dá)個(gè)下調(diào)；排在前四位的上調(diào)蛋白分別是PTX3、S-100、H1.0 和Osteoglycin，排在前四位的下調(diào)蛋白是MHC class II、Ropporin-1、SNRPF protein 和Protamine 2，研究結(jié)果表明，大量上調(diào)蛋白可能參與應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)生精細(xì)胞間粘附性及抑制生精細(xì)胞從基底膜向生精小管管腔的遷移，許多下調(diào)蛋白與精子發(fā)生相關(guān)。

Sun 等[15]同樣采用iTRAQ 方法對(duì)不同發(fā)育階段的犏牛（10、12、14 月齡）睪丸蛋白組進(jìn)行了差異分析，鑒定出12 月齡與10 月齡之間差異蛋白318 個(gè)，14 月齡與10 月齡之間差異蛋白327 個(gè)，兩種對(duì)比下的差異蛋白GO 注釋沒(méi)有明顯差異。

上述研究探究了牦牛、犏牛睪丸蛋白組表達(dá)差異，獲得了一批表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)，這些差異蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、精子發(fā)生等方面可能發(fā)揮重要作用，對(duì)不同發(fā)育階段的犏牛睪丸蛋白組進(jìn)行分析，證明了犏牛早期發(fā)育過(guò)程中睪丸生精能力就受到阻滯。

隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前對(duì)犏牛雄性不育相關(guān)研究在睪丸轉(zhuǎn)錄組上已獲得初步成果，探究了牦牛、普通牛、犏牛3 種牛睪丸組織轉(zhuǎn)錄組差異，找出了與精子發(fā)生、精原細(xì)胞分化及精細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因及非編碼RNA 的表達(dá)差異，為了更好地了解犏牛生精障礙的原因，為揭示犏牛雄性不育機(jī)理提供了基礎(chǔ)信息。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物雄性不育等領(lǐng)域。但有關(guān)犏牛雄性不育的因果關(guān)系仍不清楚，尤其缺乏蛋白質(zhì)水平的研究。因此，在現(xiàn)有科學(xué)研究進(jìn)展基礎(chǔ)上開(kāi)展牦牛犏牛轉(zhuǎn)錄組蛋白組比較研究，有助于在理論上突破犏牛雄性不育生殖障礙。