林志燕，楊 萍，黃曉會

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092）

西羅莫司又名雷帕霉素，屬新型免疫抑制劑，為他克莫司同系物，雖作用于相同受體，但免疫作用機制不同。他克莫司抑制T淋巴細胞由G0期到G1期的增殖，西羅莫司是通過阻斷不同細胞因子受體信號傳導(dǎo)，從而阻斷T淋巴細胞及其他細胞G1期到S期的進程［1－3］，與他克莫司相比，西羅莫司可阻斷T淋巴細胞和B淋巴細胞的鈣依賴性和非鈣依賴性信號傳導(dǎo)通路。西羅莫司具有抗腫瘤作用，對腎功能影響更小，目前主要應(yīng)用于肝移植術(shù)后出現(xiàn)腎功能異常、不可耐受鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（CNI）類藥品不良反應(yīng)及存在腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險的受者。西羅莫司雖具有服用方便、吸收好、起效快等優(yōu)點，但該藥個體差異大、治療窗窄，血藥濃度過高易引發(fā)肝、腎功能損傷等毒副作用，而血藥濃度過低會出現(xiàn)排斥反應(yīng)［4－6］。西羅莫司血藥濃度監(jiān)測對于指導(dǎo)臨床調(diào)整用藥劑量和頻次，制訂個體化治療方案具有重要意義。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC－MS／MS）法是以超高效液相色譜（UHPLC）為分離手段，質(zhì)譜（MS）為檢測器的綜合分析技術(shù)，集UHPLC的高分離性能和MS的高靈敏度、強專屬性于一體，極大程度地滿足了體內(nèi)藥物分析對高通量、高精密度和準確度的要求，在藥物血藥濃度監(jiān)測中發(fā)揮了越來越重要的作用，成為臨床西羅莫司血藥濃度監(jiān)測的有力工具，尤其適用于移植術(shù)后以西羅莫司為輔助用藥時血藥濃度較低者。本研究中采用UHPLC－MS／MS法測定我院肝移植患者西羅莫司血藥濃度?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）、B05.00 Masshunter色譜工作站（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

西羅莫司對照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號為CA16970700，含量為95.0%）；依維莫司對照品（European Pharmacopoeia Reference Standard公司，批號為Y0002048，含量為97.9%）；乙腈、甲醇、甲酸等均為質(zhì)譜純，水為超純水。

2 方法

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Agilent SBC18柱（50 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相為水（A）－乙腈（B，含0.1%甲酸），梯度洗脫（0～2 min時95%A→20%A，2～4 min時20%A→5%A，4～5 min時5%A）；流速：0.3 mL／min；柱溫：40℃；進樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：ESI，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式，采用正離子模式檢測；干燥氣和霧化氣均為氮氣，干燥氣溫度為320℃，干燥氣流量為7 L／min，霧化器壓力為45 psi，鞘氣溫度為350℃，鞘氣流量為12 L／min，毛細管電壓為4 kV，噴嘴電壓為0 V。西羅莫司和依維莫司離子對分別為m／z 936.5／409.5，980.6／389.3，碎裂電壓分別為330 V和340 V；碰撞能量分別為60 V和64 V。西羅莫司的二極全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 西羅莫司二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary full scan mass spectrum of sirolimus

2.2 溶液制備

取西羅莫司對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，并制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的西羅莫司對照品溶液。稱取依維莫司對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，并制成質(zhì)量濃度為70 ng／mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 內(nèi)標(biāo)全血樣品處理

精密吸取全血180μL，置1.5 mL離心管中，加入20μL內(nèi)標(biāo)工作液和800μL沉淀劑（0.2 mol／L ZnSO4－甲醇，3∶7，V／V），渦旋混勻5 min，13000 r／min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得內(nèi)標(biāo)全血樣品。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別按2.3項下方法處理空白全血、西羅莫司對照品全血和患者全血（供試品溶液），依法進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果西羅莫司和依維莫司的保留時間分別為3.266 min和3.285 min，空白全血內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾西羅莫司和依維莫司的測定。詳見圖2。

圖2 總離子流色譜圖1.sirolimus A.Blank whole blood B.Whole blood containing sirolimus C.Test solutionFig.2 TIC chromatograms

線性關(guān)系考察：制備西羅莫司質(zhì)量濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10，20，40 ng／mL的全血加標(biāo)樣品，按2.3項下方法處理，依法進樣測定，記錄峰面積。以西羅莫司峰面積與依維莫司峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)、西羅莫司質(zhì)量濃度（X，ng／mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得西羅莫司回歸方程Y＝0.0391 X＋0.0257（R2＝0.9995，n＝7）。結(jié) 果 表 明，西 羅 莫 司 質(zhì) 量 濃 度 在0.625～40.000 ng／mL范圍內(nèi)與西羅莫司峰面積和依維莫司峰面積的比值線性關(guān)系良好。

定量限考察：分別精密量取2.2項下西羅莫司對照品溶液適量，倍比稀釋，依法進樣測定，以信噪比（S／N）10∶1計算定量限。結(jié)果西羅莫司定量限為0.625 ng／mL。

精密度試驗：分別制備低、中、高質(zhì)量濃度的西羅莫司全血加標(biāo)樣品（2.00，9.00，30.00 ng／mL），按2.3項下方法處理，依法連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，計算日內(nèi)精密度；每個質(zhì)量濃度各制備5份處理全血加標(biāo)樣品，依法連續(xù)3 d每日1次進樣測定，記錄峰面積，計算日間精密度。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度西羅莫司加標(biāo)處理樣品的日內(nèi)精密度分別為5.68%，4.21%，3.20%（n＝6），日間精密度分別為9.50%，6.10%，3.75%（n＝5），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取精密度試驗項下9.00 ng／mL的西羅莫司全血加標(biāo)樣品，按2.3項下方法處理，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h時，或自動進樣器（4℃）放置0，8，16，24，32，40，48 h時，依法進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD均小于10%，表明全血加標(biāo)樣品在室溫放置12 h或4℃放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

提取回收試驗：分別制備低、中、高質(zhì)量濃度的西羅莫司全血加標(biāo)樣品（2.00，9.00，30.00 ng／mL）各3份，按2.3項下方法處理，空白全血樣品預(yù)處理后添加等量西羅莫司標(biāo)準品（即A品），依法進樣測定，記錄峰面積，計算處理后的西羅莫司全血加標(biāo)樣品與A品的峰面積比值，即得提取回收率。西羅莫司低、中、高3個質(zhì)量濃度的提取回收率分別為102.53%，101.58%，101.85%，RSD分別為9.45%，9.63%，4.30%。

基質(zhì)效應(yīng)考察：取預(yù)處理后的空白全血適量，分別加入一定質(zhì)量的西羅莫司對照品，即得質(zhì)量濃度分別為2.00，9.00，30.00 ng／mL的空白全血加標(biāo)樣品；依法進樣測定，以空白全血加標(biāo)樣品與相應(yīng)西羅莫司對照品溶液的峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果低、中、高3個質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為95.49%，99.33%，94.63%，RSD分別為9.18%，7.95%，9.98%。

2.5 我院肝移植患者西羅莫司血藥濃度監(jiān)測結(jié)果

選取2019年7月至2020年6月在醫(yī)院住院或門診監(jiān)測全血中西羅莫司質(zhì)量濃度的126例次肝移植術(shù)后患者為研究對象。其中，男106例次，女20例次；年齡29～70歲。患者晨起服藥前取靜脈血2 mL，置含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，當(dāng)日測定全血藥物濃度。126例次肝移植患者西羅莫司血藥濃度測定結(jié)果見表1，不同性別患者西羅莫司血藥濃度測定結(jié)果見表2，各年齡組患者西羅莫司藥物濃度測定結(jié)果見表3，服用西羅莫司后對肝移植患者的血常規(guī)、血脂指標(biāo)和肝腎功能的影響見表4至表6。

表1 肝移植患者西羅莫司血藥濃度測定結(jié)果（n＝126）Tab.1 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients after liver transplantation（n＝126）

表2 不同性別患者西羅莫司血藥濃度測定結(jié)果（n＝126）Tab.2 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients with different genders（n＝126）

表3 各年齡組患者西羅莫司血藥濃度測定結(jié)果（n＝126）Tab.3 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients with different age groups（n＝126）

表4 肝移植患者服用西羅莫司前后血常規(guī)比較（±s，n＝126）Tab.4 Comparison of blood routine before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

表4 肝移植患者服用西羅莫司前后血常規(guī)比較（±s，n＝126）Tab.4 Comparison of blood routine before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

注：與服用前比較，＃P＜0.05。Note:Compared with those before medication，＃P＜0.05.

時間服用前服用后 1個月3個月6個月12個月＞12個月WBC（×109 L－1）5.85±2.774.88±2.014.42±1.564.62±1.694.98±0.944.74±2.61 RBC（×1012 L－1）3.82±0.873.92±0.844.34±0.71＃4.08±0.904.35±0.674.15±0.37 Hb（g／L）114.36±21.94115.40±22.01126.85±18.82121.75±23.24132.50±21.23127.17±10.26 HCT（%）33.97±6.1733.95±6.5337.48±5.4335.76±6.6039.41±6.35＃37.73±3.84 PLT（×109 L－1）167.18±114.33146.30±69.08158.10±87.31158.50±96.20146.00±92.85160.17±103.49

表6 肝移植患者服用西羅莫司前后肝腎功能比較（±s，n＝126）Tab.6 Comparison of liver and kidney function before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

表6 肝移植患者服用西羅莫司前后肝腎功能比較（±s，n＝126）Tab.6 Comparison of liver and kidney function before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

時間服用前服用后 1個月3個月6個月12個月＞12個月ALT（U／L）44.23±49.8034.76±54.3325.84±19.0630.88±20.1331.63±22.1526.33±12.53 AST（U／L）45.73±33.4939.52±37.1735.89±25.3446.56±39.7244.75±37.4629.00±6.75 Cr（μmol／L）119.98±81.33104.05±43.3794.33±28.1587.34±35.2086.45±21.69102.37±28.66 BUN（mmol／L）13.00±11.188.95±4.367.74±3.357.32±4.637.29±1.619.08±3.07

3 討論

表5 肝移植患者服用西羅莫司前后血脂水平比較（±s，mmol／L，n＝126）Tab.5 Comparison of blood lipid levels before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，mmol／L，n＝126）

表5 肝移植患者服用西羅莫司前后血脂水平比較（±s，mmol／L，n＝126）Tab.5 Comparison of blood lipid levels before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，mmol／L，n＝126）

時間服用前服用后 1個月3個月6個月TC 4.16±1.824.55±0.825.68±0.914.83±1.15 TG 1.83±0.671.92±0.962.30±1.471.87±0.76 HDL 1.46±0.421.29±0.521.57±0.451.33±0.26 LDL 2.49±0.922.63±0.643.67±1.093.11±0.97

國外學(xué)者認為，5～15μg／L是西羅莫司合適的血藥濃度范圍［7］。國內(nèi)多數(shù)學(xué)者認為，西羅莫司血藥濃度應(yīng)維持在4～8 ng／mL，可同時獲得較高的療效和較低的高脂血癥發(fā)生率［8－9］。熊櫻等［10］認為，術(shù)后1～3個月為4～6 ng／mL，第4～6個月為3～6 ng／mL，＞6個月3～5 ng／mL，在此血藥濃度范圍內(nèi)，通過與環(huán)孢素或他克莫司聯(lián)用，可獲得較好的免疫抑制作用及較少的藥品不良反應(yīng)［10］。對于西羅莫司血藥濃度稍低于有效血藥濃度的患者，有文獻報道西羅莫司和他克莫司穩(wěn)態(tài)血藥濃度之和在6.1～15.5 ng／mL范圍內(nèi)，總體免疫抑制療效滿意［11］。西羅莫司在人體內(nèi)的生物利用度存在個體差異，影響西羅莫司血藥濃度的因素包括劑量／體質(zhì)量、年齡、疾病狀態(tài)、器官移植類型等［12］，以及食物、腹瀉、貧血狀態(tài)、藥物相關(guān)作用等其他因素［13］。西羅莫司宜空腹、餐前1 h或餐后2～3 h服用，低脂飲食，利于藥物最大吸收。聯(lián)用抑制CYP3A4代謝的藥物（如三唑類抗真菌藥、紅霉素、克拉霉素、鈣通道阻斷劑等）能增加西羅莫司血藥濃度，CYP3A4誘導(dǎo)劑（如利福平、卡馬西平等）能降低西羅莫司的血藥濃度［14－15］。臨床治療過程中需密切監(jiān)測其血藥濃度變化。西羅莫司的半衰期較長，為57～62 h，若給予負荷劑量，需3～4 d監(jiān)測血藥濃度，如不給予負荷劑量，應(yīng)在5～7 d監(jiān)測血藥濃度，一旦調(diào)整維持劑量，應(yīng)以新的維持劑量連用7～14 d后再在血藥濃度監(jiān)測下進一步調(diào)整劑量。獲得穩(wěn)定的血藥濃度后可每月復(fù)查1次，移植時間較長、血藥濃度穩(wěn)定的患者可每3個月監(jiān)測1次。

我院的126例次西羅莫司穩(wěn)態(tài)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果在3～8 ng／mL范圍內(nèi)的不足半數(shù)（53例次，42.06%）。性別對西羅莫司穩(wěn)態(tài)血藥濃度無明顯影響，而不同年齡段患者西羅莫司穩(wěn)態(tài)血藥濃度有一定差異。

除性別和年齡因素外，在今后的研究中還應(yīng)考慮患者是否同時服用其他藥物及其自身生理病理狀況等因素對血藥濃度的影響。本研究病例數(shù)較少，對西羅莫司血藥濃度的影響因素還有待數(shù)據(jù)積累研究。雖然目前我院現(xiàn)有樣本數(shù)還不足以解釋各因素對西羅莫司血藥濃度與療效間的關(guān)系，但可為臨床制訂個體化給藥方案提供參考，為本地區(qū)肝移植患者血藥濃度參考值的制訂提供依據(jù)。本研究中患者在服用西羅莫司3個月的紅細胞計數(shù)和12個月紅細胞比容與服藥前相比雖有顯著差異，但均在正常范圍內(nèi)，故無臨床意義?；颊叻幒笈c服藥前的肝腎功能、血脂指標(biāo)相比無顯著差異，得出無差異的結(jié)果可能跟樣本量較小有關(guān)。另外，由于此次觀察的病例數(shù)較少，觀察時間較短，故尚不能得出西羅莫司不同血藥濃度與患者血常規(guī)、肝腎功能、血脂關(guān)系的結(jié)論，今后還有待進一步深入研究。

綜上所述，西羅莫司在人體內(nèi)的生物利用度存在個體差異，監(jiān)測血藥濃度有助于及時調(diào)整其用藥劑量，確保臨床用藥安全、有效。