韋麗琴

（天峨縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 河池，547300）

志賀菌病（Shigellosis），也稱桿菌性痢疾，是一種主要由志賀菌（Shigella spp.）引起的急性直腸-結(jié)腸炎，臨床癥狀表現(xiàn)為水樣泄，粘液膿血便，里急后重，部分患者有劇烈頭痛、嗜睡、意識(shí)模糊、驚厥等神經(jīng)癥狀。近年來，隨著生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，我國感染志賀菌幾率逐漸增加，據(jù)調(diào)查，全世界每年有1.6 億左右人感染志賀菌，有110 萬人左右因志賀菌死亡，其中以兒童最為常見[1]。在我國，志賀菌感染患病率為百萬分之六十五[2-3]。食品中志賀菌主要是經(jīng)過食用被志賀菌污染的食物而感染疾病，以全身中毒癥狀、大腸化膿性炎癥以及潰瘍等為主要臨床特征，其主要經(jīng)過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細(xì)胞，進(jìn)而引起發(fā)熱、腹瀉、腹脹等癥狀，對(duì)患者身體健康與生命安全造成嚴(yán)重影響。目前最常用的志賀菌增菌液培養(yǎng)志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株研究中，發(fā)現(xiàn)部分志賀菌生長量顯著低于大腸桿菌等，且延遲期也較為落后。同時(shí)在普通校驗(yàn)培養(yǎng)基中部分痢疾志賀菌與鮑氏志賀菌生長不良，造成雜菌較多，因此極易引發(fā)誤檢與漏檢[4]。故針對(duì)食品中志賀菌采取高效、準(zhǔn)確性高的檢測方法，對(duì)疾病的防控具有重要意義。現(xiàn)將食品中志賀菌檢測方法的研究進(jìn)展做一綜述。

1.食品中志賀菌檢測方法

近年來，隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展，食品中志賀菌檢測與鑒定技術(shù)也在逐漸完善，其中包括常規(guī)生化檢測、快速生物檢測儀器法、免疫學(xué)檢測以及分子生物學(xué)檢測。

1.1 常規(guī)檢測技術(shù)

食物中志賀菌檢測方式以國標(biāo)法（GB 4789.5-2014）為主要檢測方式，檢驗(yàn)程序：增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離培養(yǎng)，革蘭氏染色、鏡檢，生化試驗(yàn)與血清學(xué)分離鑒定。此種檢測方式主要為微生物培養(yǎng)法，操作方式較為繁瑣，檢測周期較長，且靈敏度、特異度較低[5]；同時(shí)一次檢測完成樣品項(xiàng)數(shù)較少，無法應(yīng)對(duì)市場迅速、準(zhǔn)確檢驗(yàn)方式的需求，但這種檢測方式具有直觀、穩(wěn)定性佳、假陽性率低等優(yōu)點(diǎn)。國標(biāo)法實(shí)施常規(guī)生化鑒定方式對(duì)食物中志賀菌進(jìn)行檢測，整個(gè)檢測過程需4～5d。相關(guān)報(bào)道顯示，經(jīng)過對(duì)SS、Mac、HE 以及MT 培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果得出，SS 培養(yǎng)基對(duì)食物中志賀菌檢出率比較高，為降低漏檢、誤診等發(fā)生率，可同時(shí)使用Mac 培養(yǎng)基進(jìn)行檢測，以提升檢測準(zhǔn)確性與檢出率。

1.2 快速生物檢測儀器法

微生物自動(dòng)化檢測具有操作簡便、便捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，是微生物檢測發(fā)展方向之一。國內(nèi)外已有多種全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)問世[6]。例如Autoseptor 系統(tǒng)、Sensititre 系統(tǒng)、vitek一Ams 系統(tǒng)、Vitek 系統(tǒng)以及Midd 系統(tǒng)。其中法國生物梅里埃公司的Vitek-Ams 系統(tǒng)是眾多全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)里唯一被美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）定為的標(biāo)準(zhǔn)方式，此系統(tǒng)是以每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，儀器定時(shí)自動(dòng)檢測微量培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，計(jì)算機(jī)依據(jù)接收的發(fā)酵資料實(shí)施換算，并與數(shù)據(jù)庫所得檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)施對(duì)比[7]。

1.3 免疫學(xué)檢測技術(shù)

隨著免疫學(xué)逐漸完善，以最初凝聚試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等免疫學(xué)檢驗(yàn)方式，到先進(jìn)酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡等方式，為迅速檢驗(yàn)志賀菌提供了新的檢測技術(shù)。

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）主要是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)以及酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種的敏感性較高試驗(yàn)技術(shù)。相關(guān)研究顯示，ELISA 具有較高的敏感性以及特異性，所有可溶性的抗體抗原反應(yīng)系統(tǒng)均可檢測，最小檢測值可達(dá)至微克水平[8]。該檢測方式與放射免疫方式對(duì)比，ELISA 的標(biāo)記試劑較為穩(wěn)定，同時(shí)無放射性損傷[9]。

1.3.2 免疫印跡

免疫印跡又可稱之為蛋白質(zhì)印跡，其是一種利用特異性抗體鑒定抗原方式，使用免疫印跡方式檢測無需采取特殊設(shè)備，且操作簡便、檢測準(zhǔn)確性較高。相關(guān)研究顯示，使用IPaC 蛋白單克隆抗體免疫印跡方法檢測大便樣品中的大腸埃希菌與志賀菌，結(jié)果顯示，其與PCR 方式檢測IPaC 蛋白基因結(jié)果相一致[10]。

1.4 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)建立的眾多檢驗(yàn)技術(shù)，以其迅速、準(zhǔn)確以及高特異性等優(yōu)點(diǎn)成為生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測中。隨著微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)等迅猛發(fā)展，對(duì)病原微生物鑒定已不再局限于對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特性等實(shí)施檢驗(yàn)，以此從分子生物學(xué)水平上對(duì)生物大分子進(jìn)行研究，尤其是在核酸結(jié)構(gòu)與其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立多種檢驗(yàn)技術(shù)。其中包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)、基因芯片等，逐漸應(yīng)用于食源性病原菌的迅速檢驗(yàn)中。

1.4.1 常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

常規(guī)PCR 主要采取瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢查結(jié)果，其結(jié)果主要經(jīng)過目測有無擴(kuò)增條帶實(shí)施判斷，因此存在一定的主觀性。常規(guī)PCR 需明確待擴(kuò)增目的片段的序列，依據(jù)此序列設(shè)計(jì)一對(duì)應(yīng)引物。相關(guān)報(bào)道顯示，將志賀菌ipaH 基因序列作為靶目標(biāo)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物（5’GTTCCTTGACCGC-CTTTCCGATAC-3’與5’GCCGGTCAGCCACCCTA-3’），擴(kuò)增產(chǎn)物為700bp，其對(duì)臨床上疑似菌痢的糞便標(biāo)本實(shí)施檢測，并以PCR 為金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)法敏感性、特異性分別為72%與100%[11]。

1.4.2 RT-PCR

RT-PCR 技術(shù)主要是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，選用熒光信號(hào)對(duì)PCR 整個(gè)進(jìn)程實(shí)時(shí)檢測，隨后經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板[12]。熊輝[13]研究顯示，對(duì)2700 份肛拭子樣本使用雙色RT-PCR 法檢測志賀菌，結(jié)果顯示，雙色RT-PCR 檢出率0.11%高于培養(yǎng)法0.00%。盡管RT-PCR 檢測成本較高于熒光探針保持時(shí)間較短，但在線式采取檢測熒光信號(hào)強(qiáng)弱改變，可有效避免常規(guī)PCR 受多因素干擾影響。

1.4.3 質(zhì)粒圖譜分析

質(zhì)粒圖譜主要是經(jīng)過分析細(xì)菌中所攜帶的質(zhì)粒分子量，以及其在電泳道上形成圖譜特點(diǎn)鑒定細(xì)菌的技術(shù)。因同源性菌株所攜帶的質(zhì)粒相似，故常采取檢測質(zhì)粒圖譜的方式分析細(xì)菌來源及其某些遺傳性狀。質(zhì)粒圖譜分析方式是一種簡便、迅速以及可靠的檢測方式，故使用此種方式對(duì)志賀菌實(shí)施分子流行病學(xué)研究，有利于追蹤傳染源與掌握流行株的耐藥情況，以此為臨床治療、菌痢的檢測提供有效的理論依據(jù)[14]。

1.4.4 核糖體分型

核糖體16S rRNA 分型也是制定志賀菌亞型的分子生物學(xué)方式，其主要是借助限制性內(nèi)切酶將核糖體16S rRNA 核酸序列裂解為若干片段，使用電泳方式對(duì)片段進(jìn)行分離，同時(shí)將不同來源菌株進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，對(duì)不同菌株間變異特點(diǎn)進(jìn)行分析，以此為流行病學(xué)提供有效的理論依據(jù)。但核糖體分型在檢測志賀菌中效果并不佳，此種方式分型效力與質(zhì)粒圖譜不同，多種不同來源的志賀菌使用質(zhì)粒圖譜可分為若干型別，但使用核糖分型卻無法顯示出[15]。

1.4.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE 是目前實(shí)施志賀菌流行病學(xué)分析最常用方式之一，其主要是借助限制性內(nèi)切酶識(shí)別核酸序列上的特異位點(diǎn)，其將整個(gè)細(xì)菌染色體組裂解分為若干片段，經(jīng)過脈沖場電泳分離成像，通過不同圖型間對(duì)比，以此對(duì)同一菌種亞型的不同菌株來源及其特點(diǎn)進(jìn)行分析。雷高鵬[16]研究顯示，對(duì)30 株宋內(nèi)志賀菌實(shí)施PFGE 分型分析，結(jié)果顯示，2007-2017 年四川省腹瀉病例宋內(nèi)志賀菌分離株P(guān)FGE 優(yōu)勢帶型明顯，且部分帶型存在聚集。病原菌基因片段位置與大小表現(xiàn)存在多態(tài)性，對(duì)志賀菌分離株之間的同源性、傳染源追溯、疫情預(yù)測、防治措施提供有效的理論依據(jù)。

1.4.6 基因探針雜交與基因蕊片

基因探針是使用人工合成的方式從微生物中制備相應(yīng)的DNA 片段，進(jìn)行純化后標(biāo)記上同位素、熒光物質(zhì)以及生物等，進(jìn)而制成特異性DNA 探針，經(jīng)過對(duì)待測樣本、標(biāo)志性DNA 探針之間能否形成雜交分子進(jìn)行檢測，以此對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)微生物進(jìn)行評(píng)估。但極易引起假陽性，不利于應(yīng)急處理的迅速檢測。而基因芯片主要是使用原位合成或顯微打印方式，將數(shù)以萬計(jì)的DNA 探針固化在支持物表面，以此產(chǎn)生二維DNA 探針陣列，與標(biāo)志的物品實(shí)施雜交，經(jīng)過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品迅速、并行以及高效檢測或醫(yī)學(xué)診斷?；蛐酒夹g(shù)具有一定的敏感性高、特異性強(qiáng)以及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，其在腸道致病菌檢測中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

2.小結(jié)

目前針對(duì)食品中志賀菌的檢測方式，主要包括常規(guī)生化檢測、快速生物檢測儀器法、免疫檢測法、分子生物學(xué)方式等，上述的檢測方式均有其各自優(yōu)缺點(diǎn)，其中ELISA 在檢測食品中志賀菌中具有操作簡便、迅速以及準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，并已在臨床中廣泛應(yīng)用。因此在檢驗(yàn)食品中志賀菌中，應(yīng)充分掌握各種檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍、局限性等，同時(shí)結(jié)合實(shí)際情況，不斷完善、改進(jìn)食品中志賀菌檢測方式。同時(shí)還需建立、健全食品法律法規(guī)，以增強(qiáng)食品安全監(jiān)控，以提升檢測技術(shù)，促使食品快速檢測技術(shù)達(dá)到國際先進(jìn)水平。