顧亞娟，孟照輝

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科分子心血管病研究室，昆明 650032)

血小板在維持血管壁完整性以及生理止血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)血管受損時(shí)，內(nèi)皮下的膠原暴露，血小板黏附至血管損傷部位，進(jìn)一步發(fā)生血小板活化、聚集以及釋放凝血因子，最終形成血小板血栓[1]。血小板黏附、聚集的發(fā)生主要通過(guò)其表面的膜蛋白實(shí)現(xiàn)。血小板膜上有多種具有受體功能的糖蛋白(glycoprotein，GP)，這些膜受體主要在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮接受和轉(zhuǎn)導(dǎo)信息的作用。血小板膜蛋白作為受體與血管性血友病因子、凝血酶或膠原、層粘連蛋白等結(jié)合，將一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，刺激血小板發(fā)生形態(tài)改變、分泌釋放各種因子以及促進(jìn)血小板聚集[2]。因此，血小板膜受體功能異常很大程度上會(huì)影響血小板的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來(lái)，血小板膜受體從膜表面脫落的現(xiàn)象引起了人們的關(guān)注。研究表明，脫落是蛋白水解酶對(duì)膜受體的酶切作用，血小板膜受體有特定的“脫落酶”[3]。血小板膜受體的脫落會(huì)使血小板的黏附、聚集、釋放等特性發(fā)生改變。檢測(cè)膜受體脫落下來(lái)的片段一定程度上可以反映血小板的功能變化。目前已發(fā)現(xiàn)多種膜受體會(huì)發(fā)生脫落，其中包括黏附受體、整合素以及黏附分子等[4]，現(xiàn)就血小板膜受體脫落的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 脫落與脫落酶

受體脫落是指跨膜受體在細(xì)胞膜表面發(fā)生不可逆的降解。在生理、病理因素作用下，蛋白水解酶作用于膜表面受體，產(chǎn)生可溶性的胞外片段和膜上殘余片段[5]。血小板膜受體脫落能調(diào)節(jié)表面受體的表達(dá)，降低受體的表面密度，導(dǎo)致受體與配體結(jié)合喪失，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控血小板功能。

受體脫落是一種蛋白水解過(guò)程，這個(gè)過(guò)程需要酶的參與，稱這種酶為“脫落酶”。目前 “脫落酶”主要包含解整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)家族成員、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族成員以及鈣蛋白酶，其中ADAM與MMP主要在細(xì)胞外對(duì)血小板膜蛋白受體發(fā)揮水解作用，鈣蛋白酶則是在細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)血小板表面受體的脫落[3]。ADAM負(fù)責(zé)大部分跨膜蛋白的脫落，屬于Zn2+依賴的跨膜金屬蛋白酶超家族，由多個(gè)結(jié)構(gòu)域復(fù)合而成，包括N端信號(hào)序列、前結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、崩解素結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的區(qū)域、類表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域(ADAM10和ADAM17除外)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾[6]。人類基因組共鑒定出22個(gè)ADAM家族成員，其中有12個(gè)(ADAM8、9、10、12、15、17、19、20、21、28、30和33)編碼蛋白活性酶，目前研究較多的是ADAM10和ADAM17[7]。ADAM10和ADAM17能切割具有不同功能的底物，其中ADAM10至少有40種底物[8-9]。血小板上的ADAM10底物包括GPⅥ、GPⅤ、CD44、CD84、淀粉樣前體蛋白和表皮生長(zhǎng)因子，ADAM17的底物主要是GPⅠbα和GPⅤ[7]。ADAM切割膜蛋白的過(guò)程中，四跨膜蛋白(tetraspanins，Tspan)作為“伴侶”分子發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[10]。研究證實(shí)，Tspan14在人和小鼠的血小板中表達(dá)，Tspan14過(guò)表達(dá)抑制了ADAM10的切割，保護(hù)靜息血小板上GPⅥ免受ADAM10的切割而不脫落[11]。Tspan5能促進(jìn)CD44脫落，而Tspan15則抑制淀粉樣前體蛋白脫落[12]。除Tspan會(huì)影響膜蛋白受體的脫落外，ADAM的自身活性也有重要作用。雖然對(duì)于ADAM活性的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但快速激活A(yù)DAM10和ADAM17依賴于跨膜結(jié)構(gòu)域而不是細(xì)胞質(zhì)尾，其活性可因細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高而上調(diào)[13]。也有證據(jù)表明，ADAM10可能通過(guò)改變底物的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)介導(dǎo)膜受體的脫落，黏附分子CD44的磷酸化可導(dǎo)致其胞外結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，使之更容易脫落[14-15]。

2 多種血小板膜受體的脫落

2.1GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物由4個(gè)跨膜糖蛋白(GPⅠbα、GPⅠbβ、GPⅨ和GPⅤ)組成，4個(gè)亞基均屬于富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)家族[16]。GPⅠbα通過(guò)二硫鍵與GPⅠbβ連接形成GPⅠb，然后GPⅠb再以非共價(jià)方式與GPⅨ和GPⅤ相連，最終形成復(fù)合物[17]。GPⅠbα是該受體復(fù)合物的主要配體結(jié)合亞基，由1個(gè)球形N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個(gè)唾液酸核心、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)細(xì)胞質(zhì)尾組成[18]。GPⅠbα能夠結(jié)合多種配體，與血管性血友病因子結(jié)合介導(dǎo)血小板黏附的發(fā)生。此外，GPⅠbα的胞外域還能與FⅪ、FⅫ、凝血酶、高分子量激肽原、血小板反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞整合素αMβ2和P-選擇素等多種配體結(jié)合，在凝血和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[19]。因此，GPⅠbα胞外結(jié)構(gòu)域的完整性對(duì)其功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。GPⅠbα膜近端序列包含血小板脫落酶的切割位點(diǎn)，ADAM17是其主要脫落酶[20]。將GPⅠbα的膜近端序列(Lys450-Phe483)合成肽與ADAM17作用后進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，ADAM17能在Gly464/Val465位點(diǎn)切割GP Ⅰ bα[21]。在脫落酶的作用下，GPⅠbα的N端斷裂釋放出可溶性的GPⅠbα片段。免疫印跡可在靜息狀態(tài)的洗滌血小板上檢測(cè)到完整的GPⅠbα、GPⅠbα的N端脫落片段以及殘存的C端片段[21]。

2.2GPⅥ GPⅥ屬于免疫球蛋白超家族成員，由2個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、1個(gè)短黏蛋白結(jié)構(gòu)域、1個(gè)膜近端序列、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)細(xì)胞質(zhì)尾組成[1]。GPⅥ通過(guò)與FcRγ結(jié)合形成復(fù)合物發(fā)揮作用，F(xiàn)cRγ含有免疫受體酪氨酸激活基序，免疫受體酪氨酸激活基序激活Syk激酶并啟動(dòng)下游信號(hào)通路，導(dǎo)致血小板分泌ADP等激動(dòng)劑，進(jìn)一步使血小板活化、聚集[22]。膠原、膠原相關(guān)肽、驚厥蛋白等與GPⅥ結(jié)合后活化血小板，激活蛋白水解通路，導(dǎo)致GPⅥ的胞外域脫落。研究表明，GPⅥ胞外膜近端序列包含一個(gè)脫落酶切割位點(diǎn)，參與GPⅥ蛋白水解的脫落酶是ADAM10，免疫受體酪氨酸激活基序激活導(dǎo)致GPⅥ被ADAM10切割[22]，切割后產(chǎn)生一個(gè)約55 kDa的可溶性GPⅥ片段和約10 kDa的膜相關(guān)殘余片段[21]。由于GPⅥ的脫落具有金屬蛋白酶依賴性，激活或抑制金屬蛋白酶的活性會(huì)影響GPⅥ脫落。變性劑N-乙基馬來(lái)酰胺可直接激活A(yù)DAM10誘導(dǎo)GPⅥ脫落，也可通過(guò)鈣調(diào)蛋白抑制劑抑制鈣調(diào)蛋白對(duì)金屬蛋白酶的調(diào)控作用，誘導(dǎo)GPⅥ脫落；而乙二胺四乙酸、廣譜的金屬蛋白酶抑制劑GM6001、腫瘤壞死因子以及磷脂酰肌醇激酶、Syk激酶等GPⅥ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的抑制劑則會(huì)阻斷GPⅥ的脫落[23]。

2.3整合素 整合素是血小板膜上的黏附受體，主要發(fā)揮作用的是αⅡbβ3，通過(guò)與血管性血友病因子、纖維蛋白原或其他配體結(jié)合介導(dǎo)血小板聚集，從而在血栓形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前發(fā)現(xiàn)，在血小板內(nèi)，鈣蛋白酶對(duì)整合素β3有水解作用[24]。鈣蛋白酶能切割β3的細(xì)胞質(zhì)尾部，即水解NXXY基序，這段基序?qū)τ谂潴w結(jié)合、雙向信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞骨架的連接有重要作用[25]。關(guān)于血小板表面整合素的脫落尚未被廣泛探討，但在其他細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)存在整合素脫落現(xiàn)象，對(duì)白細(xì)胞整合素αLβ2的研究表明，一個(gè)未確定的蛋白酶既能切割β2的膜近端區(qū)域，又能切割αL釋放一個(gè)可溶性的胞外片段[26]；在巨噬細(xì)胞中，MMP-9能使整合素β2亞基脫落[27]。因此推測(cè)血小板表面可能也存在整合素脫落，但發(fā)揮作用的脫落酶以及脫落后對(duì)血小板功能有無(wú)影響有待深入研究。

2.4血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1) PECAM-1是在血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的糖蛋白受體，具有黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性。PECAM-1由胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾組成，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序，承擔(dān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[28]。PECAM-1的脫落在內(nèi)皮細(xì)胞和血小板中均有發(fā)生。在內(nèi)皮細(xì)胞中，PECAM-1在細(xì)胞凋亡過(guò)程中被caspase和MMP切割[28]；在血小板中，高剪切應(yīng)力下血小板上表達(dá)的PECAM-1發(fā)生裂解脫落，鈣蛋白酶切割PECAM-1的免疫受體酪氨酸抑制基序的上游，從而使受體失活[29]。PECAM-1的脫落受鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)，在細(xì)胞質(zhì)尾部的近膜區(qū)域含有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合序列，鈣調(diào)蛋白抑制劑可誘導(dǎo)PECAM-1的水解脫落[30]。PECAM-1的脫落對(duì)血小板功能的影響仍有待深入研究。有研究表明，PECAM-1能負(fù)性調(diào)控血小板-膠原的相互作用，PECAM-1缺陷小鼠的血小板對(duì)膠原蛋白刺激的血栓形成反應(yīng)增強(qiáng)[31]，推測(cè)PECAM-1脫落可能也會(huì)影響血栓的形成。

2.5癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1，CEACAM1) CEACAM1是癌胚抗原超家族的一員，屬癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子類，是廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞、血液細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的Ⅰ型跨膜受體，主要介導(dǎo)細(xì)胞間的同質(zhì)黏附和異質(zhì)黏附[32]。Wong等[33]發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，CEACAM1-/-小鼠的血小板Ⅰ型膠原介導(dǎo)的血小板聚集、顆粒黏附和分泌增加；在膠原和腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠急性肺血栓模型中，CEACAM1-/-小鼠較野生型小鼠更易發(fā)生肺血栓栓塞。以上研究表明，CEACAM1是血小板-膠原相互作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子，缺乏CEACAM1會(huì)影響血小板的功能，進(jìn)而影響血栓形成。既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致CEACAM 1胞內(nèi)段和胞外段雙脫落，caspase-1、3、7介導(dǎo)凋亡細(xì)胞CEACAM1的脫落[34-35]。此外，MMP可能也介導(dǎo)CEACAM1脫落。研究表明，人血小板表達(dá)MMP-12，MMP-12可在幾個(gè)位點(diǎn)切割CEACAM1胞外段并產(chǎn)生若干短肽，在這些片段中，WYKG可促進(jìn)Ⅰ型膠原誘導(dǎo)血小板α顆粒分泌[36]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MMP-12切割CEACAM1后產(chǎn)生的另一個(gè)短肽QLSN能抑制GPⅥ介導(dǎo)的血小板活化，顯著減輕膠原誘導(dǎo)的血小板黏附、聚集[37]。上述研究表明，脫落產(chǎn)生的片段仍然可能具有活性，在調(diào)控血小板功能上發(fā)揮重要作用。

2.6其他膜蛋白受體的脫落 循環(huán)系統(tǒng)中的CD40L主要存在于血小板中，活化的血小板表面表達(dá)CD40L，裂解后可產(chǎn)生可溶性CD40L片段。與CD40L脫落直接相關(guān)的酶尚未被清楚地識(shí)別出來(lái)，但研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2與整合素αⅡβ3相互作用后能使CD40L脫落，并且增強(qiáng)血小板的活化[38]。人血小板表達(dá)的免疫細(xì)胞受體信號(hào)素4D(semaphoring 4D，Sema4D)參與調(diào)控血栓形成，在動(dòng)脈血栓模型中，缺乏Sema4D的小鼠表現(xiàn)出閉塞性血栓減少，表明在佛波酯、膠原或其他激動(dòng)劑激活的血小板上，Sema4D的表達(dá)增加，促進(jìn)血栓形成；隨后在MMP的介導(dǎo)下，Sema4D脫落釋放一個(gè)可溶性胞外片段，影響了血栓的繼續(xù)形成[39]。另外，G蛋白偶聯(lián)受體也可能受MMP依賴的細(xì)胞外蛋白水解途徑的調(diào)節(jié)，蛋白激活受體-1是凝血酶的G蛋白偶聯(lián)受體，N端胞外結(jié)構(gòu)域在ADAM17介導(dǎo)下脫落[40]，但其生理作用目前尚不確定。

3 血小板膜受體脫落的臨床意義

血小板膜受體的脫落可下調(diào)血小板表面受體的密度，進(jìn)而影響血小板的生理功能，在血栓形成、血小板衰老及清除中起重要作用，脫落的胞外片段可能成為潛在的血小板特異性生物標(biāo)志物。

血小板膜受體的表面密度與血栓形成和出血風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，血小板膜受體的脫落可能導(dǎo)致血栓形成風(fēng)險(xiǎn)降低、出血風(fēng)險(xiǎn)增加。GPⅥ與膠原和層粘連蛋白結(jié)合，介導(dǎo)血小板的釋放、聚集，GPⅥ缺失不利于血栓形成[41]。血小板表面GPⅥ缺陷小鼠可能導(dǎo)致無(wú)法維持穩(wěn)定的血管閉塞[42]。血栓穩(wěn)定性降低的原因可能與膠原和纖維蛋白結(jié)合減少，以及產(chǎn)生凝血酶的能力降低有關(guān)。在血小板表面缺乏GPⅠbα胞外域表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，血栓形成明顯受損[43]，表明血小板表面GPⅠbα的脫落可能會(huì)對(duì)血栓形成產(chǎn)生一定的影響。研究表明，機(jī)械循環(huán)支持下的重癥患者血小板表面的GPⅠbα和GPⅥ減少，GPⅠbα和GPⅥ的脫落可通過(guò)抗血栓形成而增加出血風(fēng)險(xiǎn)，血漿可溶性胞外片段中GPⅥ的升高，有助于評(píng)估接受左心室輔助裝置治療心力衰竭患者的出血風(fēng)險(xiǎn)[44]。人血漿可溶性GPⅥ水平升高可由多種潛在原因造成，包括膠原暴露增加，炎癥、代謝紊亂或感染引起的血小板高反應(yīng)性，動(dòng)脈狹窄或其他原因引起血流動(dòng)力學(xué)和剪切應(yīng)力改變，凝血病以及抗血小板抗體相關(guān)的自身免疫性疾病[45]。在心腦血管疾病方面，血漿可溶性GPⅥ水平在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中存在顯著差異，包括腦卒中、冠狀動(dòng)脈疾病、心房顫動(dòng)、合并單支血管狹窄的冠心病、彌散性血管內(nèi)凝血和血栓形成性微血管病變[46-50]。可溶性GPⅥ可能成為反映個(gè)體血小板相關(guān)變化的更敏感的標(biāo)志物。

此外，血小板膜受體的脫落與血小板的衰老、清除有關(guān)。正常循環(huán)中的血小板存在一定比例的GPⅠbα水解脫落，這些脫落的GPⅠbα片段在一定程度上反映了血小板功能。研究表明，GPⅠbα的脫落與冷藏血小板的清除機(jī)制有關(guān)，GPⅠbα的脫落影響受體的密度，進(jìn)而影響血小板與吞噬細(xì)胞的相互作用，從而調(diào)節(jié)清除[51]。除冷藏血小板會(huì)發(fā)生GPⅠbα脫落外，實(shí)驗(yàn)損傷或老化的血小板也會(huì)發(fā)生脫落[20,52]。因而GPⅠbα脫落可能是血小板老化的一個(gè)標(biāo)志。與GPⅠbα不同，GPⅥ水平較穩(wěn)定，在正常循環(huán)血小板中僅檢測(cè)到GPⅥ的完整形態(tài)，未檢測(cè)到GPⅥ的水解脫落片段[21]。但血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中GPⅥ逐漸降低，與其脫落水平的增加有關(guān)[53]，GPⅥ的逐漸脫落減弱了血小板的黏附和聚集特性[54]。

4 結(jié) 語(yǔ)

血小板功能的發(fā)揮離不開膜受體，既往研究主要集中于血小板膜受體的激活及其對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路，這些受體的下調(diào)機(jī)制較少被關(guān)注。脫落是血小板膜受體的下調(diào)機(jī)制之一。膜受體在膜表面附近被脫落酶切割，隨后將脫落片段釋放入血漿。目前已發(fā)現(xiàn)多種血小板膜受體會(huì)發(fā)生脫落，這些受體的脫落導(dǎo)致受體水平失衡，導(dǎo)致血小板受體與其相應(yīng)配體無(wú)法正常結(jié)合，不同程度地影響受體介導(dǎo)的血小板活化、黏附、釋放、聚集等過(guò)程，進(jìn)而影響血小板的止血功能，表明血小板膜受體的脫落可能為抗血小板、抗血栓治療提供新的途徑。另外，受體脫落的結(jié)果是可溶性片段的生成，這意味著這些血漿可溶性片段很有可能作為調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，或成為反映個(gè)體血小板狀態(tài)的特異性生物標(biāo)志物。但目前對(duì)血小板膜受體的脫落機(jī)制及其影響仍缺乏全面認(rèn)識(shí)，對(duì)其進(jìn)一步深入研究有助于闡明血小板的病理生理變化。