嚴名揚，唐臻一

（天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科1，骨傷科2，天津 300400）

骨骼肌是人類自主活動得以實施的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和功能保障。不僅作為行動力量的提供者與協(xié)調(diào)者，而且骨骼肌功能的正常發(fā)揮能有效表現(xiàn)出生命體存在的現(xiàn)實價值。在各種類型創(chuàng)傷中，肌肉組織損傷所占的比率相對最高[1]。急性骨骼肌損傷（acute skeletal muscle injury）發(fā)生于各種機制，包括直接原因（挫傷、擠壓、拉傷、扭傷、撕裂傷）和間接原因（例如缺血、神經(jīng)功能障礙）[2-4]。由于損傷后肌肉組織血腫機化、瘢痕修復(fù)，對活動能力、生活質(zhì)量構(gòu)成現(xiàn)實的威脅；因此研究骨骼肌損傷的發(fā)病機制，了解其病理特點和臨床轉(zhuǎn)歸，探討相關(guān)的預(yù)防、治療和康復(fù)措施等，一直是臨床研究的一項重要課題[5，6]。對骨骼肌損傷發(fā)病機制的實驗研究需要建立在良好的損傷模型基礎(chǔ)上，各種動物模型的建立適用于不同的研究目的。針對不同類型的急性骨骼肌損傷模型，各損傷造模機制、肌群、實驗動物種屬等方面的選擇成為課題，本文現(xiàn)對急性骨骼肌損傷實驗動物模型種類和選擇進行綜述，旨在為此類實驗研究的開展提供參考。

1 骨骼肌急性損傷的動物實驗?zāi)Ｐ?/h2>

在對骨骼肌損傷的研究中，準(zhǔn)確地建立、復(fù)制出與人類疾病一致的動物損傷模型，是相關(guān)研究過程中的重要環(huán)節(jié)。有關(guān)骨骼肌損傷的實驗研究，主要針對于骨骼肌疾病的病因研究，故實驗性動物模型多采用物理、化學(xué)及生物學(xué)等損傷因子，對骨骼肌直接實施損傷，以此模擬并研究骨骼肌疾病的病理過程。動物實驗?zāi)Ｐ涂蓮?fù)制出骨骼肌急性損傷的典型病理變化，對深入骨骼肌損傷的實驗研究具有重要的現(xiàn)實意義[7]。目前根據(jù)損傷病因、實際操作等情況，常見的急性骨骼肌損傷模型采用的技術(shù)有：毒素注射、重物擠壓缺血、缺血再灌注損傷（橡皮筋/止血帶阻斷缺血）、失神經(jīng)支配、冷熱損傷、重物墜落、揮錘、銳性不橫斷切割、游泳/上下坡跑、電刺激損傷等張收縮、拉伸、基因敲除或細胞等成分剔除，其它疾病引起的骨骼肌損傷模型如周圍血管疾病、COPD 等。常見的急性骨骼肌損傷模型有毒素注射模型、肌肉拉伸實驗?zāi)Ｐ汀㈦姶碳p傷模型、下坡跑骨骼肌損傷模型、骨骼肌撞擊傷模型、缺血再灌注損傷模型、神經(jīng)損傷模型等，這些模型的制作為急性骨骼肌損傷的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。每項實驗?zāi)Ｐ图夹g(shù)均對應(yīng)于相應(yīng)的動物模型，所誘導(dǎo)的模型建立在不同病因基礎(chǔ)上，也表現(xiàn)出各自的特點。

1.1 開放性損傷模型

1.1.1 開放性肌肉牽拉傷模型 肌肉牽拉傷是因為肌肉主動強烈收縮（主動向心收縮）或被動過度拉長造成（被動離心收縮）引起的肌肉微細損傷，甚至肌肉部分撕裂或完全斷裂[8]。這是一種最常見的骨骼肌急性損傷，其實質(zhì)是肌肉組織承受過度載荷所致，易發(fā)于雙關(guān)節(jié)肌或多關(guān)節(jié)肌，尤其是發(fā)生在快縮肌比例高的肌肉上（如腓腸?。?，且肌肉拉傷的位置多發(fā)生于遠端的肌肉肌腱移行部位。

常規(guī)對大鼠的目標(biāo)肌肉進行遠端外科手術(shù)，暴露其肌腱，特制夾具夾持離斷的肌腱，以6 cm/min拉伸速度實施拉伸，用示波器顯示并記錄載荷—變形曲線，當(dāng)曲線進入平臺期，拉伸停止；拉伸結(jié)束后將肌腱縫合到伸肌支持帶上，并縫合刀口，完成目標(biāo)肌肉被動拉伸實驗?zāi)Ｐ?。有研究運用定負荷自由落體的方法復(fù)制了肌肉拉傷[8]，其具體方法如下：大鼠麻醉后，將準(zhǔn)備拉傷一側(cè)的下肢膝關(guān)節(jié)固定，踝關(guān)節(jié)游離，用電刺激儀刺激腓腸肌兩端，引起腓腸肌強直收縮，使踝關(guān)節(jié)跖屈。與此同時，一重物從固定高度自由下落，通過系在動物足上尼龍繩上的銅絲，以一個基本恒定的初始沖量迫使踝關(guān)節(jié)迅速背屈，腓腸肌離心收縮而被拉傷。拉伸載荷達到極限斷裂閾值80%時，其肌纖維斷裂可蔓延到遠端肌腹部分；拉伸載荷達到極限斷裂閾值90%，肌纖維斷裂進一步向肌腹部分蔓延，并有肌組織的橫向結(jié)構(gòu)和附屬組織（肌外膜、肌束膜、肌內(nèi)膜）發(fā)生斷裂[9]。

1.1.2 骨骼肌割裂傷模型 骨骼肌的斷裂模型常常采用割裂傷技術(shù)，肌肉切割傷多由銳器暴力引起，組織斷端比較整齊、血運良好，創(chuàng)面污染情況決定于損傷時的環(huán)境，嚴重者可離斷肌肉或肌腱等[4]。該模型不需要借助大型或特殊的儀器設(shè)備，易于復(fù)制，且損傷后的病理生理變化與拉傷損傷后的一致。對于該項實驗的組織學(xué)研究，關(guān)鍵是其損傷部位定位準(zhǔn)確和一致性的損傷程度。但該模型同樣面臨手術(shù)通路所引起的副損傷對模型炎癥反應(yīng)等相關(guān)研究可能存在的不良影響。

該模型的優(yōu)點是肌肉損傷程度的一致性，為損傷肌肉不同治療措施效果比較研究提供了保證。但存在的問題是與活體肌肉拉傷在生理及力學(xué)特性方面發(fā)生的形變較大，難以準(zhǔn)確反映日?；顒?、訓(xùn)練比賽中肌肉拉傷的各種特征。開放性的傷口和操作所引起的炎癥反應(yīng)，和骨骼肌組織損傷的炎癥反應(yīng)與損傷修復(fù)過程發(fā)生相互影響，進而對實驗結(jié)果的可靠性產(chǎn)生負面作用；并且拉伸實驗裝置和夾具選擇也對實驗本身產(chǎn)生相關(guān)的影響[10]。

1.2 閉合性損傷模型

1.2.1 閉合性電刺激肌肉牽拉傷模型 為消除造模過程中手術(shù)操作和皮膚傷口對模型穩(wěn)定可靠性的不利影響，采用各種電刺激方式的閉合性肌肉牽拉傷模型被開發(fā)出來。單向慢性低頻或高頻電刺激導(dǎo)致的電刺激損傷模型，是研究骨骼肌機械性和物理性適應(yīng)變化的一個很好實驗?zāi)Ｐ?；其變化常在短時間內(nèi)發(fā)生在受刺激的肌肉，在肌肉損傷及神經(jīng)肌肉功能失調(diào)等研究中具有很高的應(yīng)用價值。張勝年等[11]采取兩根銀質(zhì)針電極，刺激儀以50 V 電壓刺激脛后肌群強直收縮、踝關(guān)節(jié)趾屈；同時，拉伸實驗機以0.55 m/s 的速率反向牽拉大鼠足底固定板，迫使踝關(guān)節(jié)背屈，牽拉小腿三頭肌離心收縮，造成該肌肉急性中度拉傷。

1.2.2 力竭性骨骼肌損傷模型 力竭性骨骼肌損傷是骨骼肌損傷的主要類型之一，多見于周期性的耐力運動項目和長期的肌肉興奮。是因反復(fù)運動所致的肌纖維損傷，并且易發(fā)于骨骼肌離心運動時相，故下坡跑運動性骨骼肌損傷動物模型，以驅(qū)使動物在一定斜度的動物跑臺上進行周期性的下坡跑等訓(xùn)練方式最為多見。Armstrong RB 等[12]對大鼠在坡度為16°的跑臺上，以16 m/min 的速度持續(xù)90 min 下坡跑，導(dǎo)致肌纖維損傷發(fā)生，復(fù)制出運動性肌肉損傷模型。田野等[13]對大鼠在同樣的環(huán)境下，改變下坡跑訓(xùn)練的持續(xù)時間和間隔，復(fù)制了力竭性骨骼肌運動損傷模型。劉姣等[14]通過遞增負荷跑臺運動設(shè)計一次性力竭運動模型。此外，張宏梅探討了游泳力竭性骨骼肌損傷模型[15]。

在動物下坡跑運動性損傷模型中，肌肉抵抗體質(zhì)量形成的運動負荷而進行離心收縮做功。動物最主要的工作肌群是前肢的肱三頭肌、前臂屈肌群，故取材以實驗動物的前肢為佳。對于跑臺的斜度，根據(jù)Armstrong RB 等[12]的研究，16°是大鼠下坡跑時不打滑的最大斜度，但在實驗研究中，由于跑臺的膠帶質(zhì)地、材料不同，斜度可以適當(dāng)調(diào)整，斜度越大，模型復(fù)制效果應(yīng)該越好。但這類型模擬的是中輕度的骨骼肌損傷，并在中長期的觀察中，損傷的骨骼肌一般均能自我恢復(fù)；對臨床的實際意義不高；并且造模過程時程較長，實際可操作性欠佳。并且不同的運動方式、不同的力竭強度對骨骼肌的損傷和后期修復(fù)產(chǎn)生的作用具有差異性[16]。

1.2.3 骨骼肌撞擊傷模型 骨骼肌撞擊傷是鈍性暴力直接作用于機體某部位而引起的肌肉急性損傷，常發(fā)生于接觸對抗類體育運動（如足球、籃球、武術(shù)等運動）、社會工業(yè)生產(chǎn)、公路交通事故中，以大腿和小腿及軀干等部位最為多見。

使用撞擊傷作為骨骼肌損傷的非侵入性模型，在研究免疫系統(tǒng)與肌肉之間的相互作用中是必須的[17]。早期使用重物墜落技術(shù)的肌肉挫傷模型已廣泛應(yīng)用于骨骼肌損傷研究。Bunn JR 等[18]設(shè)計了兩個撞擊能量的損傷，表明骨骼肌的損傷程度在一定范圍內(nèi)與致傷能量成正比，并且高能嚴重的骨骼肌損傷在后期募集的巨噬細胞和成纖維細胞可能是導(dǎo)致骨折延遲愈合和不愈合的原因。Deane MN 等[19]通過對骨骼肌損傷的淺層（近皮下側(cè)）和深層（近骨骼側(cè)）肌組織的形態(tài)學(xué)等分析，總結(jié)出評價骨骼肌損傷的新模型和方法。嚴名揚等[20]采用具有沖頭定位的撞擊傷器械在腓腸肌建立了嚴重的骨骼肌損傷模型。Paun B 等[21]、吳安林等[22]在兔骨骼肌鈍挫傷模型的制備、打擊力度的關(guān)系和分期等方面對該技術(shù)進行了具體實施。

但是，這種損傷模型的局限性包括以下幾點。一方面，這些模型并沒有將腓腸肌從下面的骨骼中分離出來，這使得撞擊反應(yīng)變得復(fù)雜，并且常常因為導(dǎo)致的骨折阻礙了嚴重的肌肉創(chuàng)傷的模擬；另一方面，根據(jù)能量守恒定律，傷害勢能的參數(shù)（質(zhì)量和高度）在幾種挫傷模型中是不同的，理論上會導(dǎo)致撞擊反應(yīng)和組織損傷的差異[23，24]。迄今為止，仍缺乏使用具有可變參數(shù)的致傷勢能的重物墜落技術(shù)對從下方骨骼分離的受損腓腸肌中的撞擊反應(yīng)的研究。

1.3 特殊損傷模型

1.3.1 缺血再灌注損傷模型 缺血再灌注損傷模型常采用肢體重物持續(xù)擠壓和血管持續(xù)夾閉兩項技術(shù)。骨骼肌常常因長時間缺血而引起組織器官損傷，且再灌注導(dǎo)致組織損傷加重，即所謂的“缺血/再灌注損傷”，而氧自由基則貫穿于這一損傷的全過程。

Akimau P 等[25]使用3 kg 的重物壓迫大鼠小腿6 h、再灌注3 h 的方法設(shè)計了擠壓傷模型。通過觀察損傷區(qū)域巨噬細胞和形態(tài)學(xué)等變化，設(shè)計了血管持續(xù)夾閉通過股動脈閉塞2.5 h，再灌注2 h 建立模型[26]。張景達等人使用無創(chuàng)型動脈夾阻斷右股動脈4 h，灌注24 h 建立缺血模型；并采用缺血和灌注之間，加入“實施4 個循環(huán)30 s 再灌注/30 s 缺血”操作，以建立缺血后調(diào)適組[27]。

1.3.2 燒傷、毒素損傷模型 da Silva NT 等[2]使用腓腸肌燒傷模型的研究表明炎癥介質(zhì)COX-2 等的釋放能減輕骨骼肌的退變。同時，采用蛇毒毒素類的心毒素單次肌內(nèi)注射，引起肌纖維溶解，誘導(dǎo)小鼠急性骨骼肌損傷后再生、修復(fù)機制[28]。缺血再灌注模型的建立主要考慮的是缺血時間和再灌注時間對損傷的影響。但通過重物擠壓肢體引起的缺血再灌注損傷，和夾閉血管引起的骨骼肌再灌注損傷，在組織學(xué)和全身炎癥反應(yīng)等方面存在著差異性，并且兩組對應(yīng)的臨床病癥也有所不同。相對來說，肢體擠壓所造成的損傷更嚴重，更加接近于臨床上的現(xiàn)實狀況。除了缺血本身的完整性以外；其它因素，如遺傳背景等，也會影響急性缺血性肌肉損傷的程度[29]。

2 動物模型和肌肉的選擇

骨骼肌損傷病因的多樣性決定了相關(guān)損傷模型的多樣性。對于具體的動物模型的選擇還需考慮以下因素：發(fā)生于人類身上的損傷的嚴重程度存在個體差異，如有些模型需要采用有創(chuàng)操作及實驗取材進行的有創(chuàng)操作，這些基礎(chǔ)性的因素使對骨骼肌損傷，特別是進一步闡述諸如巨噬細胞等免疫細胞在骨骼肌損傷、修復(fù)過程中發(fā)揮的準(zhǔn)確作用和調(diào)節(jié)機制的研究更復(fù)雜。并且各物種（包括人類）之間對于損傷的修復(fù)也存在著種屬差異，而采用實驗動物難以消除這些差異，此外還涉及到醫(yī)學(xué)倫理等因素。

2.1 模型選擇 損傷后的炎癥反應(yīng)是機體啟動修復(fù)程序所必須的，因此損傷病灶區(qū)的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答成為了骨骼肌損傷研究的焦點。對于涉及免疫炎癥反應(yīng)、信號通路等研究的整體而言，骨骼肌損傷模型應(yīng)盡量減少造模過程中非主體結(jié)構(gòu)的損傷。相對于非侵入性的造模方式，侵入性的（開放傷口/針道）造模方式需在實驗設(shè)計上排除侵入操作對實驗?zāi)康谋旧淼挠绊?，即使模擬的是開放性損傷類型也應(yīng)該一樣。

重物墜落技術(shù)導(dǎo)致的撞擊傷模型研究應(yīng)用廣泛，無論是否存在骨骼肌群的暴露，多數(shù)研究采用單次撞擊。早期重物墜落技術(shù)采用了平滑的撞擊平面，并通過調(diào)節(jié)墜落高度致?lián)p特定的肌肉。有學(xué)者使用此類侵入性模型進行了損傷病灶和全身炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究。Bunn JR 等[18]的研究顯示，雖然骨骼肌傷后存在IL-1β、IL-6 和TNFα 水平改變，但是該研究缺乏假手術(shù)組進行對照，難以說明手術(shù)操作本身對相關(guān)細胞因子釋放的影響。由于骨骼肌損傷的炎癥反應(yīng)和手術(shù)副損傷的炎癥反應(yīng)在同時期啟動、活躍，可能進一步影響實驗結(jié)果。因此，在探討骨骼肌和免疫系統(tǒng)之間關(guān)系需要采用骨骼肌損傷的非侵入性模型進行研究。

非侵入的缺血再灌注損傷模型主要使用重物對肢體的壓迫或夾閉責(zé)任的血管等手段導(dǎo)致長時間的血供中斷[25]。造模過程中沒有造成撞擊性暴力損傷，其骨骼肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)在血液灌注前一般能保持初始結(jié)構(gòu)。缺血再灌注損傷和“二次打擊”的研究模型適用于肢體擠壓傷，并更多的用于其對全身其它系統(tǒng)器官的損害的研究。因此不是研究骨骼肌損傷修復(fù)機制的理想模型。雖然應(yīng)用鉗子夾持的擠壓傷能很好的定位目標(biāo)肌肉和損傷區(qū)域，但改方法仍然需要手術(shù)暴露，徒手夾持的力量大小也難以統(tǒng)一衡量，且機械性夾持也可能因夾持不均勻而影響研究結(jié)果。

重物墜落技術(shù)作為常規(guī)的骨骼肌撞擊傷模型，具有無創(chuàng)、可調(diào)節(jié)、操作簡便等特點。但此模型存在設(shè)備裝置較復(fù)雜不易獲得、擬致傷骨骼肌部位固定欠佳、致傷程度不均勻、容易導(dǎo)致皮膚破損和骨折等問題。為避免開放性造模和肌肉損傷單位的模糊性設(shè)計了定位沖頭，該系統(tǒng)引入了一個接觸目標(biāo)肌肉和起定位作用撞擊沖頭，并且該沖頭的使用還具有緩沖作用，有效降低了高頻撞擊的影響，同時將直接撞擊變?yōu)殚g接撞擊，從而實現(xiàn)了技術(shù)的進一步改進。

2.2 肌群的選擇 不同類型肌纖維的血管化程度不同，導(dǎo)致不同的肌纖維類型表現(xiàn)出不同的代謝表型。需氧的Ⅰ型纖維通過高度的血管化為肌纖維提供豐富的血供和營養(yǎng)。相反地，Ⅱb 型肌纖維為非氧依賴型，其毛細血管供應(yīng)較Ⅰ型纖維明顯減少。雖然整塊肌肉一般由多種肌纖維混合而成，但是其特性會因不同的肌肉、個體差異、物種類型的不同而不同。目前，骨骼肌擠壓傷研究的動物模型主要包括腓腸肌[30，31]和脛前肌[32]。雖然這些肌肉均含有Ⅱb 型肌纖維，但是只有腓腸肌是混合型肌肉，并含有Ⅰ型纖維。此外，腓腸肌形體相對來說較大，適合各種造模操作，而不影響骨骼，對于有利減輕痛苦及倫理審查均有利；此外，還能有效降低因骨折和周圍組織損傷所釋放細胞因子，有利于相關(guān)分子生物學(xué)的研究。腓腸肌與肱二頭肌形態(tài)相似，為扁平的長肌，常在對抗類運動中發(fā)生撞擊傷。因此，腓腸肌被認為是研究骨骼肌損傷后機體反應(yīng)、修復(fù)機制的理想肌肉。

受免疫和細胞因子系統(tǒng)的影響，不同的肌纖維類型分泌的細胞因子會有差異，如人類三頭肌、比目魚肌等在休息狀態(tài)下時TNFa 和IL-18 只在Ⅱ型纖維中表達，IL-6 主要在Ⅰ型纖維中表達[33]。單個肌肉挫傷后線粒體功能的急性反應(yīng)在快速纖維、慢速纖維等不同類型肌纖維中表現(xiàn)也不同[34]。此外，肌肉組織在破損、修復(fù)和重塑等階段中纖維類型的差異尚需進一步研究。

2.3 實驗動物的選擇 嚙齒動物是目前生物醫(yī)學(xué)研究中使用最廣泛的模型動物。近年來研究顯示，小鼠在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的作用與大鼠相比更加突出，這種轉(zhuǎn)變主要是與小鼠模型有一個更大的遺傳工具庫可用有關(guān)，特別是基于胚胎干細胞的靶向基因技術(shù)。近年來改變大鼠基因組的工具，特別是基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)使兩種嚙齒動物之間的技術(shù)差距正在縮小。為特定的生物問題選擇正確的模型系統(tǒng)時，大鼠和小鼠之間的生理、解剖、生化和藥理學(xué)差異變得越來越重要[17]。

盡管常用的大鼠（Wistar 和Sprague Dawley）和小鼠（C57BL/6 和Balb/c）同屬鼠類，并且具有許多共同特征，但在影響疾病研究模型選擇方面，特別是在神經(jīng)認知和肌肉運動領(lǐng)域存在差異。比較不同小鼠或大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)了兩組在種屬和種群層級中均存在實質(zhì)性差異，這也表明大鼠和小鼠之間的全部變異程度可能尚未被認識[35]。Ellenbroek B 等[17]的研究顯示，大鼠和小鼠在認知、成癮、沖動和社交行為的基礎(chǔ)研究中表現(xiàn)出截然相反的反應(yīng)，并且證明了神經(jīng)變性程度的差異，說明相比小鼠，合理地選擇大鼠模型作為人類疾病的“最佳”模型的重要性。此外，在結(jié)合基因敲除技術(shù)的急性骨骼肌損傷模型修復(fù)過程中，同一種類動物的不同年齡段也表現(xiàn)出差異[36]。

3 總結(jié)

建立有效的動物模型是研究骨骼肌損傷問題的首要環(huán)節(jié)，目前大量的模型建立為骨骼肌損傷的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。但在實驗中，動物炎癥反應(yīng)的啟動、免疫應(yīng)答的途徑、各種促進修復(fù)的細胞群體的募集方式、工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)還存在較大差別，故建立更接近生理狀態(tài)的骨骼肌動物損傷模型及符合運動實踐的肌肉損傷模型，對深入骨骼肌損傷的實驗研究具有重要的現(xiàn)實意義。對于以骨骼肌為實驗靶器官的研究應(yīng)該首選腓腸肌、脛骨前肌；在動物種屬選擇方面，大鼠是實驗動物倫理、實驗技術(shù)和實驗物種與人類疾患相近度等方面最合適的備選。而致傷因素的選擇決定于具體實驗的目的，操作的簡便性和標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性最容易接受。因此，在同等條件下，非侵入的實驗?zāi)Ｐ透欣趯嶒灥挠行蜻M行和實驗數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性。