蔣 凡，賀大林，吳開杰

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

膀胱癌(bladder cancer,BCa)是泌尿系統(tǒng)中僅次于前列腺癌之后第2位的常見腫瘤，在各種腫瘤中，其發(fā)病率居第11名。全世界范圍內(nèi)，男性膀胱癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為9.0/(10萬人·年)，女性為2.2/(10萬人·年)[1-2]。初診的膀胱癌中，75%為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，包括Ta、CIS、T1期。對于NMIBC患者，通常選擇經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)+術(shù)后輔助灌注治療[3]，然而50%～70%的患者會復(fù)發(fā)，10%～15%的患者會進展為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。

在NMIBC中，T1HG或T1G3膀胱癌是最復(fù)雜的一種，其臨床特征、生物學(xué)和組織學(xué)特征是可變且不可預(yù)測的，目前尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)來判斷和區(qū)分這種高危NMIBC復(fù)發(fā)和進展的風(fēng)險，對泌尿外科醫(yī)生和患者來說都是一個巨大的挑戰(zhàn)。因此，確定可以對這些患者進行危險度分層并指導(dǎo)后續(xù)治療抉擇的方法十分重要。伴隨著生物檢測技術(shù)的快速發(fā)展，通過基因測序或分子標(biāo)記物檢測對T1HG膀胱癌進行分子分型有望解決這一難題[4]，更好地指導(dǎo)臨床選擇早期根治性膀胱全切抑或保留膀胱的治療策略。

遺憾的是，膀胱癌分子分型相關(guān)的研究大多是基于MIBC完成的，關(guān)于NMIBC的基因檢測和分子分型的研究工作相對較少，也沒有形成統(tǒng)一的共識，本文將梳理高危NMIBC基因檢測或分子分型的最新研究進展以及其潛在的臨床價值，以期為高危NMIBC的臨床治療決策提供幫助。

1 膀胱癌分子分型研究現(xiàn)狀

目前有關(guān)膀胱癌分子分型的研究主要集中在MIBC，已報道的研究包括貝勒大學(xué)(Baylor)、北卡羅來納大學(xué)(the universityof north carolinaat，UNC)、德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center，MDA)、腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、Cartes d’Identité des Tumeurs Curie(CIT-Curie)和瑞典隆德大學(xué)(Lund6)6種，均基于基因測序和聚類分析的方法建立。為了便于臨床普遍開展，也有學(xué)者認(rèn)為可以利用CK5/6、CK20、CD44及GATA3等常見分子標(biāo)記物的免疫組化染色來簡單區(qū)分，分為管腔型(luminal)和基底型(basal)。對于NMIBC分子分型研究相對較少，為大家熟知的有UROMOL分型。

1.1 MIBC分子分型的共識盡管MIBC的分子分型已經(jīng)比較完善，但上述6種方法仍有不同，為了方便使用，國際上綜合上述方法，達成共識，將MIBC分為6種[5]，分別為luminal papillary型(LumP型)、luminal Non-specified型(LumNS型)、Luminal Unstable型(LumU型)、stroma-rich型、Basal/Squamous型(Ba/Sq型)和Neuroendocrine-like型(NE-like型)。在基因組改變上，LumP型主要富含F(xiàn)GFR3突變、KDM6A突變以及CDKN2A的缺失；LumNS型的主要特征是ELF3突變和PPAGR改變；LumU型腫瘤主要是發(fā)生PPAGR的突變、包含E2F3和SOX4的6p22.3區(qū)域的高水平擴增、ERBB2突變、TP53突變，它是基因組改變最顯著的一類；對于Ba/Sq型腫瘤，其主要改變是TP53和RB1突變，部分也存在3p14.2的缺失；在NE-like型中，同時存在TP53和RB1的失活；stroma-rich型的基因變化不明顯。

1.2 MIBC分子分型的特征研究表明，MIBC的分子分型與臨床特征密切關(guān)聯(lián)[5]，Ba/Sq型在女性和T3/T4分期中的比例較高，LumP型和LumU型在T2期中較多，LumP型在年齡偏小(<60歲)的患者中較多，而LumNS型在年齡偏大(>60歲)的患者中較多。同時，MIBC的基因分型有助于醫(yī)生判斷患者的臨床預(yù)后，在這6種類型中，LumP型的預(yù)后最好，LumU型和Ba/Sq型的預(yù)后相對不好，NE-like型的預(yù)后最差。

1.3 MIBC分子分型的價值MIBC的分子分型在治療方面有重要的指導(dǎo)作用，可以幫助預(yù)測化療、免疫檢查點抑制劑及其他新型藥物的療效。LumP型腫瘤中纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)的突變率和易位率高，提示LumP型腫瘤可能對FGFR3抑制劑有反應(yīng)[6]。Ba/Sq型表達高水平的表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)及配體，提示其可能對EGFR的靶向療法敏感。同時，Ba/Sq型高表達免疫檢查點標(biāo)記和抗原呈遞相關(guān)基因，提示其對免疫療法可能有較高的敏感性。NE型和LumU型腫瘤對放射療法具有潛在的反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞周期活性增強和低氧信號。在新輔助治療方面，Ba/Sq型和LumNS型腫瘤患者可能受益，stroma-rich型則不會受益?；谝陨咸卣?，可以幫助醫(yī)生為患者選擇更合適的治療方式。

2 高危NMIBC分子分型的研究狀況

目前認(rèn)為，NMIBC和MIBC之間的癌基因存在差異擴增和上調(diào)，同時在抑癌基因中也存在不同的突變和染色質(zhì)修飾行為[7]。在癌基因方面，F(xiàn)GFR3在NMIBC中更常見，通常會有較好的預(yù)后。E2F3通常在MIBC中表達增加或者上調(diào)，如果在NMIBC中出現(xiàn)，則預(yù)示進展的風(fēng)險增高。低級別腫瘤中的STAG2突變率較高，染色質(zhì)修飾基因突變率較高，例如KDM6A突變率為24%，PTEN雜合子和純合子突變分別為22%～55%和4%～6%，KMT2D失活突變?yōu)?7%，這為風(fēng)險評估提供了新的手段[7]。鑒于它們的差異，我們有必要對NIMBC進行相應(yīng)的分子分型。

2.1 NIMBC分子分型的方法

2.1.1基因(12種)分類 DYRSKJOT等[8]的一項研究發(fā)現(xiàn)周圍有原位癌(carcinoma in situ，CIS)和沒有CIS的移行細(xì)胞癌的基因表達有很大的區(qū)別，周圍有CIS的NMIBC與MIBC之間存在相似的基因表達，但沒有發(fā)現(xiàn)CIS與浸潤性癌有密切關(guān)系?；诖?，他們建立一個包含16個基因的CIS分類器，能夠根據(jù)周圍CIS的存在與否對NMIBC進行分類。在這項研究中，CIS基因特征不僅在CIS中存在，在NMIBC、MIBC及正常膀胱尿路上皮中也存在，CIS的存在與疾病進展的風(fēng)險相關(guān)。之后該團隊在原有研究的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化，確定將以下12個基因作為判斷預(yù)后的標(biāo)記，與非進展性腫瘤相比，進展性腫瘤有7種基因表達上調(diào)(KPNA2、BIRC5、UBE2C、CDC25B、COL4A1、MSN和COL18A1),有5種下調(diào)(COL4A3BP、MBNL2、NEK1、FABP4和SKAP2)，從而鑒別出進展風(fēng)險更高的腫瘤[9]。他們的這項研究是基于臨床終末結(jié)果來尋求生物標(biāo)記物，對于NMIBC的分型具有重要意義。

2.1.2UROMOL研究 UROMOL研究是一項尋找NMIBC進展預(yù)測因子的大型研究[10]，由歐洲7家機構(gòu)合作進行。該項研究納入460例NMIBC患者，通過全面的轉(zhuǎn)錄水平分析及共聚類分析，確定了一個基于117個基因的分類器，將NMIBC分為3類。在臨床特征方面，第2類和第3類中高級別、高分期、合并CIS以及進展為MIBC的腫瘤更常見。在分子特征方面，第1類和第2類均表現(xiàn)出luminal型特征，均高度表達尿路蛋白和分化相關(guān)標(biāo)記物。第1類腫瘤預(yù)后較好，細(xì)胞周期早期基因高表達。第2類腫瘤預(yù)后較差，細(xì)胞周期晚期基因高度表達，與CIS病變相關(guān)的KRT20、標(biāo)記腫瘤干細(xì)胞的ALDH1A1、ALDH1A2、NES、THY，以及與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子高度表達。第3類表現(xiàn)出basal型的特征，標(biāo)記未分化細(xì)胞(即基底細(xì)胞)的KRT5/15和CD44表達增高，其基因改變以抑制為主，具有較低的細(xì)胞周期和代謝活性，提示其可能處于休眠狀態(tài)。在第2類和第3類腫瘤中，KRT14的表達均增加，KRT14通常在KRT15表達之前的未分化細(xì)胞中高表達，提示第3類可能會轉(zhuǎn)變?yōu)榈?類。除此之外，第2類具有重要的腫瘤驅(qū)動基因突變(TP53和ERBB2)和APOBEC相關(guān)突變特征，與DYRSKJOT等確定的進展高風(fēng)險腫瘤類型具有相似的基因改變，提示其可能通過CIS通路進展。第1類和第3類具有FGFR3突變特征，提示其可能通過Ta通路進展。此項研究第一次在NMIBC中發(fā)現(xiàn)基底型特征，加深了對于NMIBC的認(rèn)識，進而優(yōu)化患者的治療與管理。

2.1.3基因(5種)分類 HEIJDEN等[11]的研究第一次聚焦T1HG高危NMIBC的分子分型。他們對無CIS的進展性和非進展性T1HG膀胱癌的差異基因表達水平進行了研究，最終確定了1組預(yù)測進展風(fēng)險的5項基因標(biāo)志(ANXA10、DAB2、HYAL2、SPOCD1和MAP4K1)，這5個基因之間并沒有直接的相互作用，在不同的途徑起作用。在之前的研究中，ANXA10、DAB2、HYAL2、MAP4K1已被證實與膀胱癌相關(guān)，SPOCD1的變化是第1次被報道與膀胱癌相關(guān)聯(lián)。相較于之前的研究，該項研究的優(yōu)勢在于使用qPCR的方法，操作簡單，成本較低，便于在臨床中開展。

2.1.4基因(8種)分類 KANG等[12]對103例NMIBC患者的標(biāo)本進行了全基因組表達分析，鑒定出與T1HG膀胱癌患者病情進展相關(guān)的8個基因(S100A8、PFKFB4、HMOX1、KIF1A、COCH和CELSR3升高，MGC17624和MTAP下降)，并基于此制作了分子進展風(fēng)險評分表(MoPRS)來預(yù)測NMIBC的預(yù)后。該評分表在1個75例T1HG膀胱癌患者隊列中得到驗證，證明MoPRS是判斷T1HG膀胱癌患者病情進展的獨立預(yù)測因子。

2.1.5基因(57種)分類 WANG等[13]開發(fā)了1種基于57種基因、利用qPCR預(yù)測NMIBC進展風(fēng)險的方法。他們通過比較已發(fā)表的膀胱癌微陣列數(shù)據(jù)集，確定了96個與侵襲性相關(guān)的基因，進而對96例膀胱腫瘤組織進行mRNA表達分析，最終篩選出57個基因(37個基因表達升高、20個基因表達降低)預(yù)測NMIBC(Ta和T1期)進展為MIBC的風(fēng)險。上調(diào)基因主要以細(xì)胞粘附、細(xì)胞外機制入侵途徑、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和有絲分裂相關(guān)基因為主；低表達基因與低分化肺癌、浸潤性乳腺癌中的低表達基因重疊，同時p53、RB1等已知的抑癌基因也在下調(diào)基因之中。在該研究中，ACTN1和CDC25B首次在膀胱癌中被提到。免疫組化證實在膀胱癌中ACTN1以胞質(zhì)表達為主，CDC25B以核表達為主。ACTN1在非侵襲性組和侵襲性組之間差異最明顯，CDC25B的表達隨疾病嚴(yán)重程度呈線性增加趨勢，這提示可以利用免疫組化的方法進行分類。該項研究匯集了之前的研究中最基本的基因，并促進了相關(guān)基因復(fù)雜相互作用的進一步研究。

2.1.6結(jié)合病理分期分級的基因分型 DESCOTES等[14]利用基因芯片對108例膀胱腫瘤進行分析，將T1期腫瘤分為病理T1a期和T1b期。首先根據(jù)腫瘤分期分級確定了322個探針的差異，相關(guān)基因主要與細(xì)胞周期基因高表達、免疫信號基因高表達和異源性代謝低表達相關(guān)。另外，進行組織學(xué)層次分類，驗證分子特征可以區(qū)分低級別(Ta低級別)和高級別腫瘤(T1b、T1a、Ta高級別)，高級別組主要與細(xì)胞周期基因高表達、免疫信號基因高表達、細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因高表達和異源性代謝低表達相關(guān)。利用qPCR在另一個膀胱腫瘤隊列中得到驗證，并確定了38個表達差異的基因。T1b期腫瘤的侵襲性比T1a期腫瘤強，更接近于MIBC，病理T1a期和T1b期二者之間存在明顯的基因標(biāo)記差別。

2.1.7下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)的應(yīng)用 以上所有這些研究都是基于微陣列技術(shù)進行的，現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)被RNA測序所取代。最近的一項研究對23例高風(fēng)險NMIBC患者進行了NGS，比較了膀胱內(nèi)治療有反應(yīng)的腫瘤和進展為MIBC的腫瘤基因組圖譜，尋找與高危NMIBC進展相關(guān)的新遺傳特征[15]。發(fā)現(xiàn)進展患者和非進展患者的DNA突變譜(TP53、PIK3CA、KMT2D、TERT的突變率)沒有差異，而CDKN2A和CDKN2B的突變和拷貝數(shù)變化可能是預(yù)測進展的生物標(biāo)志物，這表明P53的缺失可能為膀胱癌進展的早期事件，而CDKN2A和CDKN2B的丟失可能是發(fā)生膀胱癌進展的一個重要步驟，這也支持了p16/P53/RB1信號參與高危NMIBC進展的觀點。

2.2 NIMBC分子分型的價值MIBC的治療主要關(guān)注患者生存期和對輔助治療的敏感性，NMIBC治療的關(guān)鍵在于判斷腫瘤復(fù)發(fā)和進展風(fēng)險，從而選擇早期膀胱全切抑或膀胱灌注治療策略[3]。特別是對于T1G3膀胱癌，除了關(guān)注臨床病理因素，如腫瘤大小、多灶性、復(fù)發(fā)間隔、是否合并CIS、有無淋巴血管侵犯以及臨床亞分期[3]，還應(yīng)確定其分子分型，從而判斷哪些患者發(fā)生進展的幾率更大。上述研究中的分子分型辦法給我們提供了參考，便于我們來選擇行早期胱切除術(shù)或避免膀胱切除，以減少手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生及對生活質(zhì)量的負(fù)面影響。

3 NMIBC分子分型的前景

雖然NMIBC分子分型的相關(guān)研究還比較少，但隨著測序技術(shù)不斷提升和成本降低，關(guān)于NMIBC分子分型的研究將越來越多，有助于加深在基因和分子層面對NMIBC的認(rèn)識，從而更好地指導(dǎo)泌尿外科醫(yī)生治療患者，減少高風(fēng)險患者腫瘤進展和致死的風(fēng)險，低風(fēng)險患者免去切除膀胱的痛苦。