楊 丹，劉夢瑤，陳 勇

（南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院血液腫瘤科，湖南 邵陽 422000）

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年女性乳腺癌發(fā)病率已一躍成為全球首位。放療（放射治療）在減少乳腺癌復(fù)發(fā)的同時也為提高患者的生存率做了一定的貢獻(xiàn)。急性放射性皮炎是放療開始后90 天以內(nèi)出現(xiàn)的皮膚黏膜的炎癥性損傷，可表現(xiàn)為紅斑、脫皮、出血、潰瘍或局部壞死等。目前對于放射性皮炎的評判標(biāo)準(zhǔn)主要有三種，臨床上最常用的評判標(biāo)準(zhǔn)是RTOG 標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。在RTOG 標(biāo)準(zhǔn)中，急性放射性皮炎可分為5 級，0 級為皮膚無反應(yīng)組，1-2級為輕度放射性皮炎組（輕度皮炎組）,3-4 級為重度放射性皮炎組（重度皮炎組）。

Beclin1 基因是首個被鑒定的哺乳動物自噬相關(guān)基因，細(xì)胞內(nèi)的自噬活動在正常條件下處于較低水平，然而在細(xì)胞因子、缺氧等的作用下可迅速增強(qiáng)。研究表明，自噬能夠通過抑制細(xì)胞凋亡、抗細(xì)胞氧化等來參與皮膚挫傷、光損傷及燒傷等的活動進(jìn)展。相關(guān)研究表明，急性放射性皮炎的機(jī)制研究主要與炎癥反應(yīng)、膠原蛋白的變化、活性氧的產(chǎn)生、DNA 的損傷等有關(guān)[3]，而皮膚挫傷、光損傷及燒傷等的病理生理過程與放射性皮炎有著許多相似之處。因此，本文通過研究乳腺癌接受放射治療的患者皮膚組織中Beclin1 蛋白的表達(dá)情況，分析其與急性放射性皮炎的關(guān)系，初步探討B(tài)eclin1 基因在放射性皮炎中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月1日至2021年06月10日在邵陽市中心醫(yī)院乳甲外科收治和病理科存檔的73 例需進(jìn)行放療的乳腺癌患者皮膚組織蠟塊及患者臨床資料，其中皮膚無反應(yīng)組21 例，輕度皮炎組30 例，重度皮炎組22 例。各組年齡，體重等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），如表1。

1.2 檢測方法

免疫組化（酶標(biāo)記聚合物技術(shù)）所有乳腺癌皮膚組織取4μm 厚度切片，經(jīng)固定、脫水、包埋、脫蠟后，用檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，然后加入辣根過氧化物酶阻斷試劑來抑制內(nèi)源性過氧化物酶，后滴加一抗Beclin1（兔抗人單克隆抗體，長沙維世爾生物科技有限公司，按照1：300 稀釋），生物素來標(biāo)記二抗，PBS

(磷酸鹽緩沖液)反復(fù)沖洗后，最后滴加DAB 顯色劑，蘇木素復(fù)染色，1%鹽酸水溶液分化，不飽和碳酸鋰返藍(lán)，脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下讀片。用PBS 代替一抗來作陰性對照。既往研究表明，Beclin1 表達(dá)于細(xì)胞胞漿中。

1.3 結(jié)果判斷

使用免疫積分判斷標(biāo)準(zhǔn)記錄染色強(qiáng)度：未著色:0 分，淡黃色:1 分，黃色:2 分，棕褐色:3 分。從整個切片中任選5 個高密度視野（×100）進(jìn)行評分，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞。按照染色比例計分≤10%:1 分，10%<染色比例計數(shù)≤50%:2 分，＞50%:2 分。由兩位病理科專家在對臨床資料不知情的前提下進(jìn)使用半定量積分法進(jìn)行判斷。半定量積分法是指染色強(qiáng)度與染色比例的相乘積分，半定量積分≤3:陰性，＞3 分:陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS26.00 軟件，計數(shù)資料采用百分百(%)表示，乳腺癌患者皮膚組織中Beclin1 蛋白的表達(dá)率使用卡方檢驗(yàn)，P<0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01 有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1 在放射性皮炎組織中的表達(dá)

如表1及圖1所示，Beclin1 在皮膚基底細(xì)胞胞漿中表達(dá)，皮膚無反應(yīng)組中Beclin1 蛋白陽性表達(dá)率為76.19%，輕度皮炎組中Beclin1 蛋白陽性表達(dá)率為46.67%，重度皮炎組中Beclin1 蛋白陽性表達(dá)率為13.64%，三組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明在放射性皮炎的三個組別中的Beclin1蛋白陽性表達(dá)有可比性。

2.2 Beclin1 的表達(dá)與急性放射性皮炎的關(guān)系

將皮膚無反應(yīng)組、輕度皮炎組及重度皮炎組中Beclin1的表達(dá)率進(jìn)行兩兩對比，如表1所示，皮膚無反應(yīng)組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于輕度皮炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；皮膚無反應(yīng)組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于重度皮炎組，有顯著性差異（P<0.01）；輕度皮炎組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于重度皮炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計報道，中國女性乳腺癌每年發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位，死亡率居女性惡性腫瘤第四位[4]。放療聯(lián)合其他治療手段，能降低局部區(qū)域的復(fù)發(fā)率、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險等，最終影響總死亡率。

自噬借助溶酶體降解大分子物質(zhì)，回收利用基本構(gòu)件，進(jìn)行物質(zhì)周轉(zhuǎn)，參與維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[5]。自噬泡后成核并延長，募招受損大分子物質(zhì)形成自噬體，并與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體[6]。Beclin1 是自噬關(guān)鍵調(diào)控分子，其編碼的Beclin1蛋白編碼約450 個氨基酸，包含進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域（ECD)、Bcl-2 同源－3(BH3）結(jié)構(gòu)域、中央卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD）三個結(jié)構(gòu)域。通過與III 類磷酸肌苷－3－激酶VPS34 結(jié)合參與募集蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)自噬的啟動。同時介導(dǎo)其他自噬蛋白的定位及上下游蛋白的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控自噬體的形成及成熟[5]。

在大鼠皮膚挫傷的研究中發(fā)現(xiàn)，皮膚損傷后隨著時間的延長，細(xì)胞自噬增加，提示細(xì)胞自噬可能參與了皮膚損傷后修復(fù)、愈合過程[7]。研究證實(shí)miR-506-3p 在燒傷組織的真皮成纖維細(xì)胞中顯著下調(diào)，檢測表明Beclin1 是miR-506-3p 的直接靶點(diǎn)，引入Beclin1 可拮抗miR-506-3p 過表達(dá)對成纖維細(xì)胞增殖、自噬和分子間表達(dá)的抑制作用[8]。

當(dāng)皮膚受到放射性刺激時，活性氧的產(chǎn)生增加或清除下降，其不斷積累造成皮膚基底細(xì)胞增殖分化及基底層向角質(zhì)層遷移過程受限。細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗過氧化物質(zhì)阻斷活性氧對皮膚組織氧化損傷，維持氧化反應(yīng)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)放射線能氧化脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜及線粒體膜受損，引發(fā)細(xì)胞中水分丟失，毛細(xì)血管擴(kuò)張，皮膚出現(xiàn)紅斑、腫脹等損害，同時活性氧能促使DNA 結(jié)構(gòu)及功能紊亂及其不程度的丟失，生成大量核酸內(nèi)切酶胸腺嘧啶乙二醇和間接反應(yīng)DNA 損傷的8－羥基鳥嘌呤。自噬能及時清除氧化受損的細(xì)胞器，提高細(xì)胞存活率[9]。有關(guān)研究表明，神經(jīng)生長因子缺乏時，活性氧不斷蓄積，當(dāng)敲除Beclin1 與Atg 7 后，活性氧蓄積增加，自噬參與了減少神經(jīng)細(xì)胞活性氧蓄積進(jìn)展活動[10]。本研究中，Beclin1 在皮膚基底細(xì)胞胞漿中表達(dá)，Beclin1 蛋白在細(xì)胞胞漿中的定位與其自噬功能相關(guān)，考慮Beclin1 參與的自噬可能在急性放射性皮炎中發(fā)揮作用。在皮膚無反應(yīng)組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于輕度皮炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；皮膚無反應(yīng)組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于重度皮炎組，有顯著性差異（P<0.01）；輕度皮炎組中Beclin1 的表達(dá)率明顯高于重度皮炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在輕度皮炎組中Beclin1 參與自噬活動顯著增加，可能是早期干預(yù)了氧化應(yīng)激活動，從而參與減輕炎癥的發(fā)展活動。

在自噬光損傷研究中，敲除自噬相關(guān)基因beclin1、Atg5后，皮膚組織對于紫外線照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感，提示自噬具有抑制細(xì)胞凋亡并提高細(xì)胞的存活率的作用[11]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體受刺激后及時清除多余及受損細(xì)胞的程序性過程，參與機(jī)體的細(xì)胞更新。放射線可引起B(yǎng)cl-2 及Ras 等凋亡抑制基因的低表達(dá)，凋亡誘導(dǎo)基因的過表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。抑制Bcl-2 可引起線粒體膜腫脹，釋放出活性物質(zhì)細(xì)胞色素C，其和半胱氨酸蛋白酶9 形成凋亡體，引起半胱氨酸蛋白酶9 自我活化與剪切，裂解活化半胱氨酸蛋白酶3 來切割底物，導(dǎo)致蛋白級聯(lián)切割放大，最終引起細(xì)胞凋亡[12]。Beclin1 基因的BH3 結(jié)構(gòu)介導(dǎo)與Bcl-2/Bcl-XL 的相互作用，形成的復(fù)合體對于自噬活動有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。半胱氨酸酶1 是一種具有多種功能的高遷移率基群核蛋白B1，半胱氨酸酶1 在活性氧的誘導(dǎo)下容易被氧化，氧化的半胱氨酸酶1 抑制beclin1 與Bcl-2 的相互作用，以促進(jìn)自噬的過程，從而及時清除受損細(xì)胞器保護(hù)細(xì)胞[13]。

綜上，Beclin1 可能通過通過清除活性氧及抑制細(xì)胞凋亡等參與了皮膚損傷組織的修復(fù),從而及時干預(yù)急性放射性皮炎的進(jìn)展。早期干預(yù)Beclin1 陰性的乳腺癌需放療的患者，可能對治療放射性皮炎起到一定的作用，Beclin1 有望成為急性放射性皮炎的治療靶點(diǎn)，目前對于自噬對急性放射性皮炎的影響仍未得到完全闡述，自噬調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生的關(guān)系尚未明確，仍需要進(jìn)一步的研究來闡明自噬參與急性放射性皮炎的明確機(jī)制，以期對急性放射性皮炎的預(yù)測、預(yù)防、治療產(chǎn)生治療作用。