郝海靜，鄭洋，劉曉奇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，哈爾濱 150001)

椎間盤是連接于椎體之間強(qiáng)韌的軟骨關(guān)節(jié)[1]，主要由位于椎間盤中心的髓核、包圍髓核的纖維環(huán)及通過(guò)每個(gè)椎間盤頂部和底部連接相鄰椎體的軟骨終板構(gòu)成[2]。椎間盤細(xì)胞長(zhǎng)期處于低氧、低pH值、高滲透壓和應(yīng)力波動(dòng)的惡劣環(huán)境中,與纖維環(huán)細(xì)胞相比，髓核細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)依賴于椎間盤邊緣血管的擴(kuò)散作用，因此，機(jī)械應(yīng)力、損傷和衰老等均會(huì)引起血液供應(yīng)減少、軟骨終板鈣化，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向椎間盤的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)[3]。全世界約有6.37億人受腰痛的影響[4]，IDD已被證明是導(dǎo)致腰痛的首要危險(xiǎn)因素，晚期IDD還可引起神經(jīng)根痛、麻木、肌肉無(wú)力甚至癱瘓[5]，給患者帶來(lái)身心痛苦的同時(shí)也增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研究介導(dǎo)IDD的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)、尋找早期檢測(cè)IDD的敏感分子標(biāo)志物成為亟待解決的問(wèn)題。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中的重要調(diào)控因子，同時(shí)參與骨的發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持，是調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的一種重要信號(hào)通路[6-7]。Hh信號(hào)通路在人類中的表達(dá)相對(duì)保守，主要包括Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)以及Desert Hedgehog(Dhh)三種同源蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Shh及Ihh與IDD密切相關(guān)[6]。現(xiàn)就Hh信號(hào)通路在IDD中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Hh信號(hào)通路概述

Hh蛋白是目前已知的唯一同時(shí)具有棕櫚酰和膽固醇基部共價(jià)修飾的蛋白，且此種共價(jià)修飾可自發(fā)進(jìn)行[8]。Hh前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可經(jīng)自身剪切和脂質(zhì)修飾產(chǎn)生C端結(jié)構(gòu)域(Hh-C)及N端結(jié)構(gòu)域(Hh-N)，其中Hh-C能共價(jià)結(jié)合膽固醇分子，并將其轉(zhuǎn)移至Hh-N，隨后在?；D(zhuǎn)移酶的作用下，Hh-N的半胱氨酸發(fā)生棕櫚?；?，最終產(chǎn)生具有完全活性的Hh-N，激活Hh信號(hào)通路[9]。Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴初級(jí)纖毛這一高度專業(yè)化、具有感受能力的細(xì)胞器。初級(jí)纖毛呈微管樣并突出于細(xì)胞表面[10]，廣泛存在于各類細(xì)胞表面，能感受并調(diào)節(jié)Hh信號(hào)通路[11]。

1.1經(jīng)典Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成 Hh信號(hào)通路有經(jīng)典和非經(jīng)典兩條信號(hào)激活通路。經(jīng)典的Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及以下幾個(gè)關(guān)鍵成分。①Hh配體：包括Shh、Ihh、Dhh三種，均含有Hh-N及Hh-C。②受體Patched(Ptch)：包括Ptch1、Ptch2兩類，均為12次跨膜蛋白，是Hh信號(hào)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其中Ptch1是主要受體類型，而Ptch2在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起次要補(bǔ)充作用[8]。③跨膜蛋白Smoothened(Smo)為7次跨膜蛋白，與G蛋白偶聯(lián)受體同源，屬于F類G蛋白偶聯(lián)受體，具有3種狀態(tài)：SmoA和SmoB呈未活化狀態(tài)、SmoC呈活化狀態(tài)，是Hh信號(hào)的換能器[12]。④效應(yīng)蛋白為轉(zhuǎn)錄因子Gli，是由GLI基因編碼且具有鋅指結(jié)構(gòu)，在脊椎動(dòng)物中有3種亞型：Gli1參與激活目的基因轉(zhuǎn)錄，Gli2和Gli3既能激活又能抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄[13]。⑤下游靶基因：包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(fused，F(xiàn)u)、Fu抑制劑(SuFu)、驅(qū)動(dòng)蛋白樣分子2(Cos2)、蛋白激酶A、Hh相互作用蛋白等，在Hh的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中Fu起促進(jìn)作用；而SuFu、Cos2、蛋白激酶A、Hh相互作用蛋白等起抑制作用[14]。

1.2經(jīng)典Hh信號(hào)的調(diào)節(jié)過(guò)程 位于初級(jí)纖毛底部的Ptch在無(wú)Hh配體時(shí)與Smo形成復(fù)合物，這阻礙了Smo向初級(jí)纖毛的轉(zhuǎn)移、運(yùn)輸和定位，從而抑制其活化，同時(shí)阻塞了SuFu與Gli分離所需的信號(hào)級(jí)聯(lián)，Gli則被依賴環(huán)腺苷酸的蛋白激酶A磷酸化后分解為Gli抑制物，Gli抑制物抑制細(xì)胞核內(nèi)目的基因轉(zhuǎn)錄。蛋白激酶A的調(diào)節(jié)亞基和催化亞基均位于纖毛基底部，感受環(huán)腺苷酸促進(jìn)Gli抑制物的生成，這一過(guò)程導(dǎo)致Gli轉(zhuǎn)錄因子失活，下游Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)暫停[15]。當(dāng)初級(jí)纖毛感受到Hh信號(hào)時(shí)，Hh與Ptch受體結(jié)合，Smo進(jìn)入原纖毛，抑制蛋白激酶A從而引起Gli與SuFu的解離，激活Gli，同時(shí)解除對(duì)Smo的抑制作用，Smo即向初級(jí)纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)移，到達(dá)纖毛頂端與SuFu相互作用，使Gli活化，激活的Gli(GLIA)從Gli-Cos2-Fu-SuFu組成的胞質(zhì)復(fù)合物中游離出來(lái)，以全長(zhǎng)形式進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因成員與目的基因啟動(dòng)子結(jié)合，使目的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[14]。由此可見，經(jīng)典的Hh信號(hào)激活通路依賴Hh配體和Smo[16]，而非經(jīng)典通路則不依賴Hh和Smo，可通過(guò)其他信號(hào)(如Wnt、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)直接激活Gli使其轉(zhuǎn)錄[17]。

2 Hh在椎間盤發(fā)育形成過(guò)程中的作用

脊椎動(dòng)物均有一段椎骨和椎間盤交替的節(jié)段，該節(jié)段在胚胎發(fā)育中起源于中胚層的脊索和體節(jié)，分別是形成椎間盤和脊柱的結(jié)構(gòu)[18]。椎間盤在胚胎發(fā)育過(guò)程中，纖維環(huán)來(lái)自間葉[19]，而髓核起源于脊索[20]。Hh在椎間盤形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，已有研究證明，在胚胎椎間盤形成過(guò)程中，Shh主要在小鼠脊索細(xì)胞中高表達(dá)[21]，而Ihh主要在小鼠胚胎椎體的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞以及后期形成的軟骨終板中高表達(dá)[22]。鞏婷婷和陳建權(quán)[23]研究表明，在小鼠胚胎椎間盤形成過(guò)程中，ShhCreERT2能在小鼠胚胎的早期階段特異性靶向標(biāo)記髓核細(xì)胞，而在椎間盤形成后期，髓核細(xì)胞內(nèi)Shh表達(dá)水平逐漸降低；相反，Ihh在椎間盤形成的早期表達(dá)水平較低，在脊索細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)，但到發(fā)育后期，髓核細(xì)胞內(nèi)則開始出現(xiàn)大量的Ihh。另有研究證明，在椎間盤成熟期間，較大、空泡樣的脊索細(xì)胞被較小的、非空泡樣的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞所取代，這一過(guò)程在人出生時(shí)就已基本完成[24]。以脊索細(xì)胞丟失為特征的年齡相關(guān)性椎間盤病變從兒童時(shí)期就已開始，30歲以下人群中有40%，55歲以上人群中有90%出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性IDD[25-26]，提示IDD的發(fā)病與脊索細(xì)胞的凋亡和消失密切相關(guān)。可見，Shh和Ihh在椎間盤的發(fā)育形成過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用：Shh是調(diào)控脊索細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞的重要信號(hào)通路，而Ihh與椎間盤胚胎發(fā)育后期軟骨終板的形成密切相關(guān)；Shh信號(hào)的生理性沉默或Ihh信號(hào)異常激活可能誘導(dǎo)脊索細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致IDD的發(fā)生；同時(shí)，這兩種Hh信號(hào)通路在椎間盤形成及退變過(guò)程中具有時(shí)間遞進(jìn)關(guān)系，提示可能存在一個(gè)潛在的中間作用靶點(diǎn)，其在終止上游Shh信號(hào)調(diào)控椎間盤發(fā)育成熟的同時(shí)啟動(dòng)下游Ihh信號(hào)參與IDD，但有待深入研究和證實(shí)。

3 Ihh信號(hào)通路在IDD中的作用

3.1Ihh信號(hào)通過(guò)誘導(dǎo)軟骨終板鈣化加劇IDD Hh信號(hào)通路被認(rèn)為在胚胎發(fā)育成熟后成為沉默通路，但可在缺血、組織損傷、嚴(yán)重的機(jī)械負(fù)荷等病理?xiàng)l件下被激活[27]。Ihh是軟骨細(xì)胞中主要的Hh配體，已被證明在膝關(guān)節(jié)軟骨變性中發(fā)揮重要作用，在人和鼠骨關(guān)節(jié)炎組織中被激活[28-29]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2是與成骨相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也在軟骨細(xì)胞中表達(dá)并激活基質(zhì)金屬蛋白酶13和Ⅹ型膠原的表達(dá)，Gli2和Gli3已被證明是Ihh通路中促進(jìn)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2表達(dá)的主要信號(hào)分子[30]。在所有的膠原種類中，Ⅹ型膠原被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志，并參與鈣化形成[31]。Wang等[32]收集了接受腰椎融合手術(shù)且磁共振成像顯示終板發(fā)生ModicⅠ、Ⅱ型改變患者的終板軟骨標(biāo)本，對(duì)比無(wú)Modic改變的腰椎爆裂術(shù)后患者的終板軟骨標(biāo)本，通過(guò)體外培養(yǎng)軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)法分析發(fā)現(xiàn)，存在Modic改變的患者軟骨終板細(xì)胞標(biāo)本中Ihh的表達(dá)明顯升高且與變性的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，同時(shí)，在退變的軟骨終板細(xì)胞中，除Ihh外，下游靶基因Gli1、Gli2、Gli3及基質(zhì)金屬蛋白酶13、Ⅹ型膠原的表達(dá)也被上調(diào)，表明在退變的軟骨終板細(xì)胞中，Ihh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活可能通過(guò)上調(diào)Gli基因的表達(dá)使骨化相關(guān)基因過(guò)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨終板細(xì)胞發(fā)生鈣化而加劇IDD。可見，Ihh信號(hào)的異常激活與IDD密切相關(guān)，Ihh可能成為IDD潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

3.2Ihh-甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)負(fù)反饋通路延緩IDD Ihh被認(rèn)為主要在生長(zhǎng)板和關(guān)節(jié)軟骨水平上具有生物學(xué)作用[33]。PTHrP廣泛表達(dá)于人體骨、心、腎、腦、皮膚等器官組織并介導(dǎo)相關(guān)生理作用。已有研究表明，在生長(zhǎng)板水平上，Ihh和PTHrP在軟骨內(nèi)骨化過(guò)程中存在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的負(fù)反饋通路：由前肥大生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的Ihh可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，而關(guān)節(jié)周圍軟骨細(xì)胞產(chǎn)生PTHrP可阻止增殖的軟骨細(xì)胞離開增殖生長(zhǎng)板區(qū)，當(dāng)PTHrP靶向過(guò)表達(dá)時(shí)會(huì)阻礙肥大軟骨細(xì)胞的產(chǎn)生，而軟骨細(xì)胞的數(shù)量不足以再被PTHrP刺激時(shí)，Ihh的合成與軟骨細(xì)胞的增殖將會(huì)停止[33]。Bach等[34]分別通過(guò)體外去分化實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)及免疫組織化學(xué)法分析對(duì)比了犬和人椎間盤成熟過(guò)程中脊索細(xì)胞表型的自然喪失期間和IDD期間PTHrP、Ihh及兩者相關(guān)受體的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在椎間盤失去脊索細(xì)胞表型的過(guò)程中，PTHrP及其受體1和Ihh受體的表達(dá)逐漸下降；在成熟或變性期間，Ihh的表達(dá)無(wú)變化；而在椎間盤變性期間，PTHrP及其受體1和Ihh受體的表達(dá)增加，同時(shí)Ihh具有在體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞鈣化的傾向，而PTHrP未見影響鈣化水平，推測(cè)可能是由于PTHrP在體內(nèi)抑制了椎間盤鈣化過(guò)程，則在后期的表達(dá)不會(huì)被上調(diào)。因此，Ihh-PTHrP負(fù)反饋通路在體內(nèi)可能具有抑制Ihh蛋白表達(dá)從而延緩椎間盤鈣化的作用，同時(shí)，抑制Ihh信號(hào)可能是治療IDD的一種方法。然而，Ihh-PTHrP負(fù)反饋通路介導(dǎo)IDD的具體機(jī)制仍不明確，其與受體Ptch、轉(zhuǎn)錄因子Gli及跨膜蛋白Smo等在IDD中的作用關(guān)系是未來(lái)研究的重要方向。

4 Shh協(xié)同其他蛋白通路逆轉(zhuǎn)IDD

Shh與椎間盤的形成和維持有關(guān)[35]，Choi和Harfe[36]通過(guò)使用他莫昔芬誘導(dǎo)Shhflox/CreERT2等位基因小鼠胚胎，在8.5～10.5 d時(shí)條件性地靶向抑制Shh，發(fā)現(xiàn)椎間盤和椎骨形成缺陷，闡明了Shh在脊索鞘和脊索細(xì)胞形成中的關(guān)鍵作用，表明Shh信號(hào)對(duì)于胚胎早期的椎間盤形成至關(guān)重要。Winkler等[1]對(duì)小鼠模型的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，來(lái)自髓核細(xì)胞的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的控制，這兩種通路均隨著年齡的增長(zhǎng)而下調(diào)，并伴隨椎間盤中細(xì)胞外基質(zhì)和其他分化標(biāo)志物的表達(dá)水平下降。在老化的椎間盤中，這兩種通路的活動(dòng)均下調(diào)，但這種下調(diào)是可逆的，通過(guò)激活退變椎間盤中的Wnt和Shh通路可以上調(diào)隨老化而丟失的椎間盤分子標(biāo)志物的表達(dá)。近年的研究表明，Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以在成年和老年小鼠的椎間盤中被重新激活，僅細(xì)胞子集的初始激活就足以重新激活和再生整個(gè)椎間盤[37]。因此，針對(duì)Wnt和Shh信號(hào)通路的生物療法作為治療IDD的方法可能是可行的。此外，Casey等[38]研究表明，Shh信號(hào)還可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而促進(jìn)新生小鼠椎間盤中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子表達(dá)從而延緩IDD。然而，Shh與Wnt信號(hào)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子途徑在IDD中相互作用的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。可見，Shh發(fā)揮延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD的作用需要多條通路協(xié)同參與，Shh信號(hào)有望作為中間共同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為椎間盤再生研究的高效作用靶點(diǎn)。

5 Hh信號(hào)抑制劑在IDD中的研究現(xiàn)狀

Hh信號(hào)抑制劑的研究對(duì)于深入闡明Hh信號(hào)在IDD中的作用和尋找延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD的治療靶點(diǎn)具有重要意義。Hh信號(hào)抑制劑主要包括Hh配體抑制劑、Smo拮抗劑、Gil抑制劑等，分別在Hh信號(hào)通路的不同水平發(fā)揮作用。其中，Hh配體抑制劑在骨關(guān)節(jié)炎及軟骨變性中研究最多，包括一些植物提取物也被發(fā)現(xiàn)能夠抑制Hh信號(hào)通路，如白藜蘆醇及環(huán)巴胺等[39]。宋先兵等[40]研究證明，使用環(huán)巴胺溶液處理佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞24 h后，Shh、Ptch1及Gil蛋白的表達(dá)水平均有下降趨勢(shì)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明體外環(huán)巴胺給藥可顯著抑制Hh信號(hào)通路的活化。Guo等[41]研究證明，伊普黃酮作為種新型、安全的Ihh信號(hào)抑制劑，可以通過(guò)阻斷Ihh信號(hào)通路來(lái)減緩軟骨變性，為大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎提供軟骨保護(hù)。但目前上述抑制劑在IDD中的作用均鮮有報(bào)道，由于關(guān)節(jié)軟骨與椎間盤的組成具有一定相似性，且骨關(guān)節(jié)炎與IDD的發(fā)病均被證明與Hh信號(hào)通路有關(guān)，環(huán)巴胺和伊普黃酮應(yīng)用于IDD具有較大研究?jī)r(jià)值。然而，現(xiàn)有Hh信號(hào)抑制劑(Ihh或Shh抑制劑)的相關(guān)研究存在許多問(wèn)題：①特異性靶向抑制Ihh或Shh的藥物有待證明，目前研究報(bào)道僅通過(guò)免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法間接證明Ihh或Shh表達(dá)升高或下降，這可能與含生物活性的N端在Ihh和Shh具有很高的同源性，且兩者共享下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)；②由于Ihh和Shh在椎間盤發(fā)育及退變不同時(shí)期中的特殊作用，僅單一研究Ihh或Shh在IDD中的作用可能導(dǎo)致研究結(jié)果的偏差，如只證明抑制Ihh信號(hào)可延緩IDD，而忽視Shh可能同時(shí)因IDD異常激活而產(chǎn)生同樣的椎間盤再生作用；③Hh信號(hào)抑制劑在椎間盤細(xì)胞中的毒理作用仍需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明，為后期開發(fā)安全、高效的藥物應(yīng)用于IDD治療提供依據(jù)。

6 結(jié) 語(yǔ)

Hh信號(hào)通路與IDD關(guān)系密切且復(fù)雜。首先，在胚胎椎間盤的形成階段，Ihh與Shh分別在不同時(shí)期發(fā)揮介導(dǎo)椎間盤形成和發(fā)育成熟的作用，而這一作用在成年期隨著Hh信號(hào)的沉默而消失；但椎間盤變性時(shí)，Ihh信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的異常激活可進(jìn)一步上調(diào)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)甚至加重IDD，而Shh信號(hào)的激活則使IDD的逆轉(zhuǎn)成為可能。其次，由于Ihh與Shh共享下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，兩者在介導(dǎo)IDD中的作用仍不明確，甚至在不同的研究中得出相互矛盾的結(jié)果，有待于進(jìn)一步深入研究。此外，Hh信號(hào)通路的激活還受其他細(xì)胞信號(hào)通路的影響，表明Hh信號(hào)可能是介導(dǎo)IDD的共同中間通路。最后，Hh信號(hào)通路的抑制劑在IDD中的研究鮮有報(bào)道，應(yīng)作為今后研究的一個(gè)重要方向?？傊?，Hh信號(hào)通路在IDD中的研究前景廣闊，值得通過(guò)改進(jìn)和完善實(shí)驗(yàn)方法深入研究。