周嘉青 陶 璐 顏克香 欒 菁 張喬安 潘潔雯 張正華△ 沈 蕾

（1復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科 上海 200040；2上海交通大學醫(yī)學院上海市免疫學研究所 上海 200025）

尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PV）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，由機體在多基因遺傳背景和環(huán)境因素等作用下，出現(xiàn)免疫系統(tǒng)過度活化導致的自身炎癥和自身免疫反應［1-2］。汗孔角化癥（porokeratosis，PK）則是一種少見的常染色體顯性遺傳的角化異常性皮膚病，可由甲羥戊酸（mevalonate，MV）通路上致病基因的缺陷引起固有免疫亢進（自身炎癥），進而導致角化過度，目前已被歸類到自身炎癥性角化?。?-5］。國內外均有PV和PK共存的病例報道［3，6-13］，PV可見于家族性或者散發(fā)PK患者。以往的基因表達譜研究支持PV和PK在分子水平上具有相似性的觀點［14-15］，提示了二者在自身炎癥機制中可能存在相關性。體內細胞在炎癥反應或腫瘤形成過程中可出現(xiàn)增殖和/或活化，發(fā)生代謝重編程，促進MV通路，為合成膽固醇和甾類激素等提供重要的前體［16］。真皮IL-17+γδT（γδ17T）細胞在PV的炎癥應答中發(fā)揮重要作用［17-18］，而MV通路上的多種磷酸化代謝產物是γδT細胞的強效激動劑［16］，提示MV通路有可能通過激活γδT細胞分泌炎癥因子而參與PK發(fā)病。雖然大多數PK患者攜帶MV通路上的基因突變，但目前尚不清楚其γδT細胞的數量和功能是否存在異常。本研究通過比較PV、PK患者與正常對照（normal control，NC）的外周血Vγ9Vδ2 T細胞比例、皮膚趨化表型和分化表型的變化，為深入研究γδT細胞參與自身炎癥和角化過度提供實驗依據。

資料和方法

研究對象本研究經復旦大學附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準（KY 2017-367）。2017年10月至2018年12月，來自皮膚科門診的33例斑塊狀PV和19例PK患者，以及33例健康志愿者在獲得充分說明后簽署書面知情同意書。入選標準：常規(guī)檢查無其他器質性病變；在1個月內均未接受系統(tǒng)治療，2周內均未外用糖皮質激素、維A酸和卡泊三醇等藥物。PV受試者至少由兩位醫(yī)師診斷為斑塊狀PV，其中男性18例，女性15例，年齡18～65歲，平均36.67歲；病程1～29年，平均11.67年；銀屑病皮損面積和嚴重度指數評分（psoriasis area and severity index，PASI）為4～38.4分，平 均16.03分 。根據2018年中國銀屑病診療指南對疾病嚴重程度的界定標準［19］，其中11例為中度銀屑病患者（3

主要試劑和儀器APC-Cy7-抗人CD3（Clone SK 7）、BV 786-抗人CD45RA（Clone HI100）及同型對照均購自美國BD Bioscience公司；PE-抗人CLA（REA 1101）及同型對照購自德國Miltenyi Biotec公司；PE-Cy7-抗人Vδ2（Clone B6）、APC-抗人Vγ9（Clone B3）及同型對照、人Fc受體阻斷劑（Human TruStain FcX?）均購自美國Biolegend公司；PECy5-抗 人CD27（Clone O323）及 同 型 對 照、Live/Dead Blue染色試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司 ；Ficoll-Hypaque購 自 加 拿 大 Stemcell Technologies公司。96孔圓底培養(yǎng)板為美國Corning公司產品；流式細胞儀（LSRFortessa?X-20）為美國BD Bioscience公司產品；Flow Jo流式分析軟件購自美國Tree Star公司。

研究方法

PBMCs分離 每例PV、PK和NC組對象取外周血10 mL肝素鈉抗凝，使用Ficoll-Hypaque進行密度梯度離心常規(guī)獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）進行重懸，備用。

流式細胞術檢測 每例標本取1×106個細胞，在100μL Live/Dead Blue（1μg/mL）溶液中室溫避光孵育15 min，PBS洗滌，加入25μL受體阻斷劑（濃度10μg/mL）室溫避光孵育5 min，再加入25μL APC-Cy7-抗人CD3、APC-抗人Vγ9、PE-Cy7-抗人Vδ2、PE-抗人CLA、PE-Cy5-抗人CD27、BV 786-抗人CD45RA熒光標記的單克隆抗體（濃度20μg/mL），在4℃下避光孵育30 min，洗滌緩沖液洗滌后重懸，用BD LSRFortessa?X-20流式細胞儀檢測上述抗體表達，用Flow Jo軟件進行分析。

統(tǒng)計學分析數據中連續(xù)性變量用±s表示，采用GraphPad Prism V.8.0統(tǒng)計學軟件，單因素t檢驗進行各組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

PV與PK患者的PBMCs中Vγ9Vδ2 T細胞比例均出現(xiàn)顯著下降如圖2A所示，流式細胞術圈門Vγ9Vδ2 T細胞，確定Vγ9Vδ2 T細胞占CD3+T細胞比例。結果顯示，相較于NC組［（5.30±3.93）%］，PV組［（3.36±2.68）%］和PK組［（3.32±2.48）%］均顯著下降（t=-2.349，P=0.0224；t=-2.226，P=0.030 6）；PV組與PK組之間差異無統(tǒng)計學意義（圖3A）。

PV與PK患者的CLA+Vγ9Vδ2 T細胞比例均出現(xiàn)顯著下降皮膚淋巴細胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）是一種皮膚淋巴細胞歸巢的表面標志物。如圖2B所示，流式細胞術圈門CLA+Vγ9Vδ2 T細胞，確定CLA+Vγ9Vδ2 T細胞占總Vγ9Vδ2 T細胞的比例。結果顯示，相較于NC組［（23.44±14.95）%］，PV組［（12.70±11.44）%］和PK組［（13.97±8.59）%］均顯著下降（t=-3.277，P=0.001 7；t=-2.901，P=0.005 5）；PV組與PK組之間差異無統(tǒng)計學意義（圖3B）。

PV與PK患者的Vγ9Vδ2 T細胞分化表型存在相似性根據CD27和CD45RA的表達狀態(tài)（圖2B），Vγ9Vδ2 T細 胞 分 為 幼 稚 型（na?ve T cells，TNa?ve；CD45RA+CD27+）、中 央 記 憶 型（central memory T cells，TCM；CD45RA-CD27+）、效應記憶型（effector memory T cells，TEM；CD45RA-CD27-）及終末分化型（effector memory T cells expressing CD45RA，TEMRA；CD45RA+CD27-）［20］。以上4個細胞亞群在NC組的比例分別為（17.23±11.36）%、（57.39±18.17）%、（13.50±9.73）%和 （11.88±9.16）%；在PV組 中 分 別 為（35.49±13.59）%、（34.58±19.38）%、（7.04±5.59）% 和 （22.89±13.66）%；在PK組 中 分 別 為（23.43±16.11）%、（44.23±17.02）%、（10.17±10.39）%和（22.17±18.83）%。與NC相比，PV組的TCM和TEM的比例出現(xiàn)顯著下降（t=-4.932，P<0.0001和t=-3.303，P=0.001 8），TEMRA比 例 則 顯 著 升 高（t=3.849，P=0.000 3）；PK組中也出現(xiàn)TCM比例明顯下降（t=-2.572，P=0.013 1）和TEMRA比例相應升高（t=2.236，P=0.035 3），TEM的比例與NC組相比差異無統(tǒng)計學意義（圖3C）。

討 論

γδT細胞是一種非傳統(tǒng)的固有樣T細胞，由前體T細胞在胸腺中發(fā)育而來，可在機體發(fā)育早期轉移到皮膚和黏膜中成為組織駐留細胞，參與抵御病原體的感染和炎癥反應［21-22］。γδT細胞的表面表達特異性的T細胞受體（T cell receptor，TCR），與傳統(tǒng)的αβT細胞不同，γδT細胞無主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制性，可直接識別細胞產生的內源性或細菌病毒等病原體產生的外源性小分子磷酸化抗原，快速產生IFN-γ、IL-17等細胞因子，在固有和適應性免疫應答中發(fā)揮著重要的橋梁作用［23］。外周血γδT細胞約占CD3+T細胞的5%，以Vγ9Vδ2亞型最常見。本研究結果支持Laggner等［24］的發(fā)現(xiàn)，即PV患者外周血中Vγ9Vδ2 T細胞和皮膚趨化表型CLA+Vγ9V 2 T細胞的比例均明顯減少。此外，Laggner等［24］還發(fā)現(xiàn)PV皮損處Vγ9Vδ2 T細胞的比例增多，對于成功獲治的PV患者，其外周血Vγ9Vδ2 T細胞的比例可恢復至正常范圍。劉鈞天等［25］采用實時熒光定量PCR的方法對銀屑病皮損處γδT細胞TCR進行分析，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，PV組皮損Vγ9的表達明顯升高，PV組外周血PBMC中Vγ9的表達降低。由此可見，外周血的Vγ9Vδ2 T細胞在PV發(fā)作時可能遷移至皮損，參與皮膚的免疫應答。

依據表面分子CD27和CD45RA的不同，Vγ 9Vδ2 T細胞可分成4個具有不同功能的亞群。幼稚型TNa?ve細胞經小分子磷酸化抗原的激活，可分化為中央記憶型TCM細胞，部分TCM與TNa?ve細胞可歸巢至次級淋巴器官儲備，不參與免疫應答；另一部分TCM細胞則繼續(xù)分化為效應記憶型TEM和終末分化型TEMRA細胞，主要遷移至外周組織，參與免疫應答。其中，以TEMRA的促炎和細胞毒性能力最強［20，26］。與NC組相比較，我們發(fā)現(xiàn)PV組Vγ9Vδ2 T細胞的分化表型中記憶型TCM和TEM的比例顯著減少，終末分化型TEMRA細胞顯著增多。Vγ9Vδ2 T細胞可能受到內源性和外源性磷酸化抗原的反復刺激，從記憶型TCM和TEM分化為TEMRA細胞。這些終末分化型TEMRA細胞通過分泌促炎因子來發(fā)揮炎癥效應，也是結核、手足口病和細菌性腦膜炎等感染性疾病患者外周血Vγ9Vδ2 T細胞的主要表型［27-29］。

De Simone等［12］報道1例PV患者在接受光療后，多數皮疹已消退，但是其腰部的環(huán)形斑塊卻持久不退，經皮膚病理最終診斷為PV伴發(fā)斑塊型PK，表明這兩種疾病在臨床和發(fā)病機制上可能存在相關性。本研究PK組中有1名56歲男性患者，伴有PV病史40年。他在17歲時頭皮先出現(xiàn)紅斑和鱗屑，2年后，其雙下肢出現(xiàn)鱗屑性丘疹和斑塊，當時臨床診斷為PV，曾口服中藥和外用藥物（具體不詳），接受紫外光療等。40歲時，他曾間歇肌肉注射曲炎舒松注射液近1年，停藥后皮疹反復；41歲時，其面部、軀干和四肢陸續(xù)出現(xiàn)深褐色環(huán)形斑疹，結合皮膚病理和臨床表現(xiàn)，診斷為淺表播散型PK?；颊咧髟V其95歲母親有類似PK皮疹，伴PV病史30年。與NC組相比較，PK組外周血中Vγ9Vδ2 T細胞和皮膚趨化表型CLA+Vγ9Vδ2 T細胞的比例，以及表型分化的趨勢與PV組基本保持一致。記憶型TCM向炎癥效應型TEMRA過度分化，是固有免疫亢進的表現(xiàn)，該細胞可能遷移至皮膚，參與皮膚的自身炎癥應答。

本研究發(fā)現(xiàn)PV和PK患者的外周血Vγ9Vδ2 T細胞比例和表型具有相似性，為將來干預γδT細胞來調控皮膚自身炎癥的研究提供了依據。

作者貢獻聲明周嘉青，陶璐 采集樣本，流式細胞術實驗，數據統(tǒng)計分析，論文撰寫和修訂。顏克香，欒菁，張喬安，潘潔雯 采集樣本，數據分析和解釋。張正華，沈蕾 研究設計，數據統(tǒng)計分析指導，論文撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。