方玲娟，林小春，徐彰，黃開宇，陳檜平，閆秀梅

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童消化科，浙江 溫州 325027

Citrin缺陷?。–itrin deficiency, CD）由SLC25A13基因變異導致編碼Citrin蛋白缺失和功能異常引起的一種常染色體隱性遺傳性疾病。臨床上主要包含CD缺陷所致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD）[1]、CD所致的生長發(fā)育落后和血脂異常（failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD）[2]和成人發(fā)病瓜氨酸血癥II型（adult-onset type II citrullinemia, CTLN2）[3]三種類型[4]。

NICCD是一種泛種族疾病，尤其以東南亞國家多見，我國多省市均有NICCD的報道，各地發(fā)病率、SLC25A13基因變異特征及攜帶率均存在一定的差異。迄今為止，浙江省關(guān)于嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中SLC25A13基因變異的相關(guān)文獻僅有3篇，共報道了6例NICCD患兒，其中1例合并膽道閉鎖。本研究分析溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院就診的未明原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中SLC25A13基因的變異特征，了解本地區(qū)的疾病譜特征，為臨床診療提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年1月至2020年12月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童消化科住院的未明原因嬰兒膽汁淤積癥病例。納入標準：①年齡小于1歲；②結(jié)合膽紅素升高（血清總膽紅素高于85 μmol/L，結(jié)合膽紅素占總膽紅素的20%以上；或者血清總膽紅素低于85 μmol/L，結(jié)合膽紅素大于17 μmol/L）。排除標準：①除外肝外膽道疾病，包括膽道閉鎖、膽道囊腫或腫瘤等；②除外持續(xù)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）低于50 U/L和（或）總膽汁酸（total bile acid, TBA）低于10 μmol/L；③除外感染（包括細菌感染，如尿路感染、敗血癥等，以及血清學陽性病毒感染，如弓形蟲、風疹病毒、EB病毒、單純皰疹病毒、HIV、梅毒螺旋體感染等），但未排除巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染患兒，因為CMV感染在嬰兒中常見，感染后其預后與未感染患兒無明顯差異，且存在CMV感染并不能排除其他病因，尤其是遺傳性病因；④排除甲狀腺功能低下、靜脈營養(yǎng)史等。

1.2 方法 經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會批準，并經(jīng)患兒家屬簽署知情同意書后，留取患兒及其父母親的外周EDTA抗凝血 2 mL，抽提基因組DNA。先證者基因組DNA樣本進行二代測序（包括膽汁淤積性肝病Panel或者全外顯子組測序），并加測SLC25A13基因常見的兩個大片段熱點變異位點c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb。再根據(jù)二代測序檢測結(jié)果，對患兒及其父母DNA標本進行SLC25A13基因Sanger測序驗證。

1.2.1 二代測序（next generation sequencing, NGS）及一代驗證：采用液相捕獲試劑盒捕獲，通過NGS儀IlluminaHiSeq 2000（美國Illumina公司）完成高通量測序，測序平均深度不小于200。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，進行基因序列生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)的變異位點再進行一代測序驗證。此部分分別委托北京邁基諾基因檢測公司和北京金準基因檢測公司完成。

2.3 新發(fā)變異L603P的致病性分析 該變異位點位于SLC25A13基因的第17號外顯子，通過檢索中國知網(wǎng)、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫，均未見文獻報道，為新發(fā)現(xiàn)的變異位點。通過檢索多個人類遺傳變異體數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該位點在不同地區(qū)不同人群中的等位基因變異頻率極低：在千人數(shù)據(jù)庫中為0；在EXAC數(shù)據(jù)庫中不同人群中均為0；在GnomAD數(shù)據(jù)庫中東亞和南亞人群為0，歐洲人群中則為1.8/10萬。對該變異位點氨基酸保守性分析顯示此位點氨基酸在不同物種間具有高度保守性，見表2。另外，多個變異功能預測軟件分析均顯示該位點變異為致病性變異。具體如下：在Mutation Taster分析中顯示該位點變異可顯著影響功能，為致病性變異，其分值為0.871（分值越接近1，功能影響越大）；在SIFT分析中顯示為有害變異，分值＜0.001（＜0.05提示為有害變異）；在Provean分析中提示為有害變異，分值為-6.73（≤-2.5提示為有害變異）；在Polyphen2分析中提示為有害變異，分值為0.832（＞0.8提示為有害變異）；在M-CAP和CADD分析中均提示為致病性變異，分值分別為0.304（＞0.025提示為致病性）和28.2（＞20提示為致病性）。

2.2 基因檢測結(jié)果 30例中10例進行了膽汁淤積性肝病Panel檢測（包含SLC25A13基因），18例進行了全外顯子檢測，另有2例直接進行SLC25A13基因全部外顯子檢測。同時所有病例都加測了中國人群中常見的大片段變異位點c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測。共發(fā)現(xiàn)12例患兒攜帶SLC25A13基因變異，其中2例純合變異，5例復合雜合變異，5例雜合變異，見表1。SLC25A13基因的總檢出率為40%（12/30）。在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測到存在SLC25A13基因致病性變異，其中2例純合、4例復合雜合以及2例雜合。還有4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因致病性變異，包括1例復合雜合變異和3例雜合變異。另外3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異。共檢測到19個致病性變異位點，7個不同的變異類型，包括中國人群中最常見的4個致病性變異，分別為c.852_855delTATG，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb，以及2個次常見致病性變異c.1177+1G＞A和c.1399C＞T，同時發(fā)現(xiàn)一個未報道的新發(fā)變異位點c.1808T＞C，p.L603P。其中c.852_855delTATG占總檢出致病性變異的52.63%（10/19），c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出致病性變異的10.53%。4個常見致病性變異占總檢出致病性變異的84.21%（16/19），4個常見致病性變異和2個次常見致病性變異占總檢出致病性變異的94.73%。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料用百分比表示，組間兩兩比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.1 一般資料 共30例未明原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒納入本研究，其中男18例，女12例。除1例患兒父母為近親婚配外，其余所有患兒的父母均非近親。其中29例患兒進行了血氨基酸質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)8例瓜氨酸升高伴或者不伴其他氨基酸升高（如甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸），3例甲硫氨酸升高，1例酪氨酸升高，另外17例未見明顯氨基酸代謝異常。

1.2.3 判讀方法：測序結(jié)果利用SeqScape 2.0軟件進行分析，然后利用DNAMAN5.1.5軟件（LynnonBiosof，美國）與SLC25A13基因序列（Ensembl Genome Browser：ENSG0000004864）進行比對。變異類型根據(jù)人類基因組變異學會（http://varnomen.hgvs.org/）標準進行命名。致病性分析根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）發(fā)布的序列變異的解釋標準指南進行[5]。SLC25A13基因Ensembl參考序列為ENSG00000004864，Genbank參考序列為NM_014251.3。編碼的氨基酸Ensembl參考序列為ENSP00000265631.1，Genbank參考序列為NP_055066.1。檢測到的變異通過檢索PubMed、HGMD、ClinVar等在線數(shù)據(jù)庫進行比對。已知的致病性變異、經(jīng)典剪接位點變異、無義和框移變異均被認為是致病的。對新發(fā)的錯義變異分別進行人群變異頻率分析、氨基酸同源性分析、變異功能預測分析等，以確定其致病性。

2.4 瓜氨酸代謝異常與基因譜的相關(guān)性 在12例檢測到SLC25A13基因變異的患兒中，共8例入選瓜氨酸血癥組，3例入選非瓜氨酸血癥組。另外1例由于血氨基酸檢測時患兒膽汁淤積癥已完全緩解，轉(zhuǎn)氨酶恢復正常，參考意義不大，故不適合入組分析。對比瓜氨酸血癥組和非瓜氨酸血癥組中的基因變異類型，發(fā)現(xiàn)2組基本以非錯義變異為主，基因變異類型差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；比較2組間等位基因變異數(shù)量，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸血癥組中等位基因變異的數(shù)量顯著高于非瓜氨酸血癥組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。

美國、加拿大、澳大利亞等國制定并完善了礦業(yè)生態(tài)補償相關(guān)措施。例如美國的“濕地融資計劃”，澳大利亞的“環(huán)境凈收益計劃”，加拿大要求礦業(yè)主與政府簽署“損益協(xié)議書”，做好利益分配和生態(tài)補償[13]。同時還著重對廢棄礦山進行改造，發(fā)展礦山公園和礦業(yè)旅游。

國家政府應(yīng)該加大對女性就業(yè)的政策幫扶，通過政治手段和法律手段規(guī)范就業(yè)體制，完善對女性就業(yè)的權(quán)益保護；社會要發(fā)揮媒體的宣傳效應(yīng)，加大對女性就業(yè)的正面宣傳，引導女大學畢業(yè)生更加自信更加清楚的面對社會客觀形式，提高自身能力，保持清醒的意識，客觀擇業(yè)。各應(yīng)聘單位一定要客觀公平公正公開的進行合法招聘，避免性別歧視和人為設(shè)置“就業(yè)壁壘”，根據(jù)理工科女大學畢業(yè)生的特點為她們設(shè)定一批能夠發(fā)揮她們自身最大商業(yè)價值的競聘崗位。

2 結(jié)果

證明 定義如下：對任意x ∈ X, = (x → 1) → 1).首先證明是X的猶豫模糊濾子.顯然， ? 對任意x ∈ X都成立，即(HF1)成立.對任意x,y ∈ X, 由命題1.1和引理2.1知，

1.2.2 熱點變異c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測：①位點c.1638_1660dup23bp：這是一段23 bp序列的重復，在該位點的兩端設(shè)計引物（F：CAGGAGAGGCATGGTTGCATTTCCC；R：GACTTAC GAATTGCTACAGCGATGG），PCR片段長度為480 bp，用普通PCR進行擴增再送去一代測序即可。目標區(qū)域序列為GAGATTACAGGTGGCTGCCCGGG，如樣本沒有出現(xiàn)23 bp的重復，判定為野生型（negative），反之則為變異型（positive）。②位點IVS16ins3kb：這是一段3 kb的片段插入變異，在該位點的兩端設(shè)計引物（F：GGAGCAGACATCTTGCACAC；R：TGATGAGAATG TATCAACTCC），如果有插入，PCR之后會出現(xiàn)大于 3 kb的條帶；如果沒有插入，結(jié)果只有703 bp的條帶。為了確認這一結(jié)果，再對PCR產(chǎn)物片段偏大的樣本進行一代測序，如果樣本出現(xiàn)了3 kb的堿基插入，判定為變異型（positive）。

企業(yè)在資金使用的過程中，需要進行嚴格的科學論證，不能盲目擴大規(guī)模，防止資金斷流，讓企業(yè)陷入經(jīng)營困境。對于中小型餐飲企業(yè)而言，提升企業(yè)自身經(jīng)營實力，發(fā)展品牌效益，是企業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個關(guān)鍵因素。

不錯，簡東亮是李若的房東，當初李若到廣州來打拼的時候，發(fā)現(xiàn)房租貴得要命，她繞來繞去地找朋友，就租到了簡東亮的房子。他貸款買的50平的兩居室，月供要還20年，路漫漫其修遠兮，出租個房間給李若也是為了緩解一下房貸壓力。

3 討論

SLC25A13基因變異所致NICCD在新生兒期及嬰兒早期常表現(xiàn)為血氨基酸異常，尤其以瓜氨酸血癥為最典型[6-7]。通常為了提高SLC25A13基因變異篩查效益，多以血氨基酸明顯異常作為主要篩選指標，進行高頻致病性變異的篩查[2，6，8-9]。本研究中在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測到存在SLC25A13基因變異，可見瓜氨酸血癥在NICCD病例中具有高度特征性，是臨床識別NICCD的重要指標，與既往研究[6]一致。本研究中3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異，與既往研究[6]不一致。另外，本研究中4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因變異，提示對于臨床不存在氨基酸代謝異常的膽汁淤積病例需要保持警惕，要考慮NICCD的可能性，以免發(fā)生漏診，延誤診治。另外，本研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸血癥患兒中等位基因變異的數(shù)量明顯高于非瓜氨酸血癥患兒，提示等位基因變異數(shù)量越多對Citrin蛋白功能影響越大，故越易導致臨床上出現(xiàn)瓜氨酸血癥。近幾年，多個研究[6，10-12]表明， 雖然瓜氨酸血癥在NICCD中具有特征性，但是在新生兒期以及嬰兒期仍然存在血氨基酸代謝篩查陰性的NICCD患兒，這部分病例容易誤診、漏診，對于缺乏典型臨床表現(xiàn)的病例，需考慮采用NGS進行基因檢測。

研究發(fā)現(xiàn)日本最常見的致病性變異類型是c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[13]，而韓國人群中最常見的致病性變異類型是IVSl6ins3kb、c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[14]。LIN等[10]報道的中國人群中最常見致病性變異為：c.852_855delTATG（58.33%）、IVSl6ins3kb（10.04%）、c.1638_1660dup（8.52%）、c.615+5G＞A（7.58%），且存在地區(qū)差異，c.852_855delTATG在南方高，北方低，而IVSl6ins3kb在南方低，北方高。基因變異的地區(qū)差異可能與人種遷移及祖先來源有關(guān)。本研究先證者中檢出的變異類型中，以4種高頻變異最常見，其中c.852_855delTATG占總檢出變異的52.63%，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出變異的10.53%，與LIN等[10]的研究相一致，本研究中的病例來源于溫州，溫州地處浙南地區(qū)，位于北回歸線以南，變異特征與地理區(qū)域分布相吻合。國內(nèi)報道了多個不同地區(qū)關(guān)于SLC25A13基因變異研究，從中國北部到中國南部，從中國東部到中國西部，c.852_855delTATG變異在總變異中的頻率為46.57%～58.33%，可以看到該變異占絕對優(yōu)勢，近半數(shù)的病例攜帶c.852_855delTATG變異。LU等[13]報道中國正常人群中c.852_855delTATG等位基因攜帶率為1.08%（45/4169），對于我國龐大的人口基數(shù)來說，c.852_855delTATG變異位點攜帶者數(shù)量相當可觀，需要重視，尤其是有關(guān)優(yōu)生優(yōu)育方面，減少或避免遺傳代謝病嬰兒的出生。

本研究是溫州地區(qū)，乃至浙江地區(qū)首個CD的隊列研究，SLC25A13基因變異總檢出率為40%，提示Citrin缺陷是嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中的重要病因，亦是嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中居首位的遺傳性代謝性病因。隨著對CD的認識逐步加深，研究的進一步深入，新發(fā)變異逐步被發(fā)現(xiàn)。本研究檢測到一個新發(fā)變異c.1808T＞C，p.L603P，該變異位點為罕見變異位點，變異功能預測分析提示為致病性變異，新變異的發(fā)現(xiàn)豐富了SLC25A13基因變異譜。以上發(fā)現(xiàn)為NICCD確診提供了可靠依據(jù)，也為相應(yīng)家庭的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了科學依據(jù)。

本研究的不足之處在于3例患兒存在SLC25A13基因單個雜合變異，且未提示存在明顯瓜氨酸血癥，無法確診NICCD。本研究僅對已知常見的大片段的插入或缺失變異進行檢測，可能遺漏罕見、未報道到的，甚至是內(nèi)含子區(qū)域的大片段的插入或缺失變異。另外，對于新發(fā)現(xiàn)的變異，僅進行變異功能預測，未進行體外功能研究，未來可以對新變異的功能改變進一步進行研究。

SLC25A13基因變異所致CD是未明顯原因嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥中居首位的遺傳代謝性病因，以c.852_855delTATG，p.M285Pfs*2為最常見變異類型。新發(fā)現(xiàn)的變異位點豐富了SLC25A13基因的變異譜。