朱 鵬 張志明 雍文興 王功臣 呼永華 宋忠陽 吳亞娜 蘇 歡 杜婷婷

肺癌是全球發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌(non-small cell lunch cancer,NSCLC)發(fā)生率占據了肺癌的絕大多數[1]。Ⅰ期NSCLC患者術后5年生存率可達80%以上，但由于早期特異性診斷標志物缺乏等原因，NSCLC患者確診之時往往已處于晚期，故NSCLC患者的5年生存率僅為5%左右[2]。因而迫切需要發(fā)現敏感度、準確率更高的早期診斷方法及治療方法以提高NSCLC患者的生存率。近年來，基因組學和蛋白質組學迅猛發(fā)展，人們對外泌體有了更深入的研究，外泌體攜帶的多種生物分子活性成分參與細胞的遷移、通信與生長、血管的新生等生理和病理學過程[3]。因此，外泌體為NSCLC提供了新的研究途徑，能夠成為早期診斷和治療的潛在生物學標志物[4]。

一、外泌體概述

1.外泌體的起源、結構、組成及分布：外泌體(exosomes)是由多種活性細胞分泌的具有脂質雙層膜結構的納米級囊泡，最早可追溯到1983年，是Johnstone等在研究網織紅細胞成熟的過程中被發(fā)現并命名的[5]。質膜循環(huán)途徑中的膜腔或早期胞內體是其產生的起源，而后向內凹陷形成管腔內膜泡并發(fā)展成多泡小體，在細胞內分子馬達的牽引下，多泡小體與細胞表面融合，最終被分泌出去，此被稱之為“內吞-融合-外排”調控過程[6]。外泌體形態(tài)規(guī)則，呈杯狀或雙凹蝶形，大小均勻，直徑為30～100nm。外泌體其內含大量的生物活性物質如：①蛋白質：由在外泌體中普遍存在的膜轉運和融合相關蛋白(Alix、Rab蛋白、TSG101、G蛋白等)、細胞骨架成分蛋白、整合素和四跨膜蛋白(CD81、CD63、CD9等)等固有蛋白及與細胞來源和組織類型相關的特異性蛋白兩大類組成[7]；②核酸：包括長非編碼RNA(lncRNA)、各種RNA亞型、雙鏈DNA、微小RNA(microRNA或miRNA)等[8]；③脂質：包括磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、神經節(jié)苷脂、膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂等[9]。無論在生理或病理條件下，一些細胞均可以胞吐的方式將外泌體釋放入各種體液之中，包括尿液、血液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、母乳、精液、羊水、腦脊液、腹腔積液、膽汁等，通常采用差速離心法可得到外泌體[10]。

2.外泌體的生物學特性：經研究證明，外泌體在各種細胞的生理和病理過程中起著重要的作用，作為細胞外微環(huán)境的重要成分之一，歸結起來，外泌體的生物學功能如下[11]：(1)細胞通訊與物質傳遞。首先，外泌體可參與細胞間信息傳遞及物質運輸：外泌體不僅能夠作為信號復合物通過受體介導直接刺激靶細胞，還可通過轉運核酸、蛋白質、細胞器、膜受體等生物活性成分進入靶細胞內，從而影響靶細胞基因的轉錄和翻譯并調節(jié)細胞信號通路，最終改變靶細胞的表型及功能狀態(tài)。經研究發(fā)現，它在改變相鄰細胞的生物學功能的同時還可對相距遙遠細胞的功能產生重要影響。(2)促進血管與神經新生。外泌體可促進血管的生成進而促使傷口愈合，又可促進損傷神經的修復。(3)促進腫瘤細胞生長。(4)參與免疫應答與免疫調節(jié)。(5)介導抗原遞呈等。

二、外泌體在NSCLC早期診斷中的作用

外泌體與其他生物學標志物比較有著明顯的優(yōu)勢，其生物活性物質miRNA和蛋白質因受雙層脂質保護可長期穩(wěn)定存在于血清、血漿或其他體液之中而免受蛋白酶或RNA酶的降解。同時，在癌癥患者體液中外泌體更容易被分離和分析，因此外泌體可能替代NSCLC傳統(tǒng)的診斷方法應用于臨床，成為在臨床診斷中較理想的生物學標志物。

1.外泌體相關miRNA與NSCLC的診斷：miRNAs是一類含有20～25個核苷酸的非編碼小RNA，可通過結合其靶mRNAs的3′ UTR來調節(jié)靶基因轉錄水平上的基因表達，從而導致靶基因表達的改變。通過對正常肺組織和NSCLC肺組織對比發(fā)現，NSCLC肺組織中miRNAs的表達量明顯較高，目前miRNAs多被發(fā)現存在于NSCLC患者的外泌體中，參與NSCLC的形成及演化過程。因此，外泌體的miRNA具有成為NSCLC診斷標志物的潛質。Poroyko等[12]在NSCLC患者血清中發(fā)現7個外泌體miRNA (hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-16-2-3p及hsa-miR-15b-5p) 的敏感度均≥83.33%，特異性均≥87.50%，AUC均≥0.88，且與健康志愿者的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明血清外泌體miRNAs有成為早期診斷NSCLC的潛力。但化療后NSCLC患者血清中無可用于鑒別與健康志愿者的特異性外泌體miRNAs。

余昌敏等[13]研究發(fā)現，NSCLC患者血清中3個miRNA(hsa-miR-451a、hsa-miR-331-5p及hsa-miR-363-3p)可依靠100%的特異性和敏感度來鑒別出治療前的NSCLC和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)患者。說明這些血清外泌體中對于NSCLC診斷具有高敏感度的miRNAs同時還具有鑒別SCLC和NSCLC的能力，有望在不久的將來成為NSCLC早期篩查診斷的生物學標志物。Jin等[14]研究發(fā)現，NSCLC患者血漿外泌體中的miR-24-3p、let-7b-5p及miR-486-5p含量明顯高于健康對照者但let-7e-5p水平較其降低。為進一步研究及證明外泌體miRNAs對NSCLC早期的診斷價值，Jin等聯(lián)合其他團隊對60例尚未確診的NSCLC患者血漿中l(wèi)et-7e-5p、let-7b-5p、miR-486-5p4及miR-23a-3p等外泌體的差異性表達進行檢測，最終鑒別出43例NSCLC患者，因此，外泌體相關miRNA這種無創(chuàng)且高敏感度的診斷方法可提高NSCLC的早期診斷率。此外，Su等[15]查閱文獻發(fā)現，利用qPCR技術和miRNA測序檢測42例健康志愿者及41例Ⅰ期NSCLC患者血漿外泌體中的Ct值及其miRNA，以篩選診斷NSCLC的特異性miRNA，結果發(fā)現miR-361b-5p、miR-181b-5p、miR-320b及miR-10b-5p這4種miRNA具有鑒別NSCLC、肺鱗癌及肺腺癌患者的能力，說明外泌體中的miRNA在肺癌的診斷及鑒別診斷中發(fā)揮著重大作用，并為尋找診斷早期NSCLC的生物學標志物提供理論依據，進而可能會代替組織活檢成為診斷NSCLC的非侵入性分子標志物。

美國Exosome Diagnostics公司于2016年初研發(fā)的基于血漿外泌體的間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)試劑盒已被相關機構批準用于臨床，這是世界上第1個以血漿為樣本分析外泌體RNA的臨床檢測[16]。它可以實時、準確地檢測NSCLC患者EML4-ALK融合基因突變的情況，該項檢測也被證明具有高達100%的診斷特異性和88%的診斷敏感度。

2.外泌體相關蛋白質與NSCLC的診斷：據研究報道，外泌體中除miRNA外的特異性蛋白質也可以作為診斷篩查NSCLC的生物學標志物并可促進NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，是早期診斷NSCLC的有效途徑。有研究者對NSCLC患者和健康志愿者血清ELISA檢測時發(fā)現，ECM1及AH-SG外泌體蛋白在NSCLC患者與健康志愿者間的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義，特異性為56.6%，敏感度為75.0%，AUC為0.656 (95% CI:0.528～0.785)[17]。他們還將ECM1和AH-SG聯(lián)合進行檢測發(fā)現，NSCLC及早期NSCLC患者，特異性為54.3%，敏感度為87.5%，AUC為0.739 (95% CI: 0.621～0.858)，這顯著提高了NSCLC患者診斷的敏感度。另有報道稱，NSCLC患者血漿外泌體中高表達的EGFR、CD91及CD317等蛋白均可作為NSCLC早期診斷的生物學標志物且多個外泌體蛋白標志物聯(lián)合檢測對NSCLC診斷更具優(yōu)勢[18]。

近年來，基于質譜的高通量蛋白質組學的研究使得對NSCLC外泌體蛋白質的篩選方法提升到了新的高度，這為我們提供了更多具有生物學標志物價值的分子。Clark等[19]運用穩(wěn)定同位素標記氨基酸的方法檢測并分析了NSCLC患者和健康對照者支氣管上皮細胞外泌體之間的721種生物蛋白的差異性表達，篩選出了溶質載體家族3成員2、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子、溶酶體膜糖蛋白2及癌胚抗原相關黏附分子6等多種對NSCLC診斷篩查具有高特異性和敏感度的蛋白標志物，若將其開發(fā)并應用于NSCLC患者液體活檢的外泌體蛋白診斷芯片，較單一的生物學標志物將具有更高的開發(fā)和診斷價值。Sandfeld-Paulsen等[20]研究了127例健康對照者和336例肺癌患者血漿外泌體中49種蛋白表達情況后發(fā)現，CD151、CD171及TSPAN8不僅能作為區(qū)分肺癌組織與正常組織鑒別診斷的生物學標志物，同時對于區(qū)分各種肺癌組織的亞型也具有較高的價值。進一步研究發(fā)現，這3種蛋白聯(lián)合應用時診斷NSCLC的AUC可達0.74。目前對診斷篩查NSCLC外泌體蛋白雖有了一定的成就和較多的研究報道，但已篩選出的蛋白生物學標志物尚需開展進一步的臨床驗證，相信隨著蛋白質組學研究的不斷深入，用于診斷NSCLC外泌體蛋白的標志物將會被不斷被發(fā)現。

3.其余外泌體相關內容物與NSCLC的診斷：外泌體中除miRNA、蛋白質以外的其他分子如環(huán)狀RNA(circRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNAs)也有望成為診斷NSCLC的生物學標志物。Li等[21]研究發(fā)現，NSCLC細胞和組織中circRNA_0000735的表達量均明顯升高，且其表達與淋巴結浸潤及TNM分期有關。進一步研究發(fā)現，circRNA_0000735可顯著提高NSCLC細胞的增殖、遷移及侵襲能力，又可明顯抑制癌細胞的凋亡。其機制可能為circRNA_0000735與miR-1179/1182結合，從而發(fā)揮了生物學功能。另有一項研究顯示，SNHG6作為19個LAPro LncRs中的其中一個，在NSCLC患者血漿中的表達呈異常狀態(tài)，故可能作為NSCLC中肺腺癌的非侵入性檢測的一個生物學標志物[22]。

三、外泌體在NSCLC治療中的作用

近年來，外泌體所介導的治療肺癌的新方式備受青睞和關注。研究表明，外泌體及其相關成分對NSCLC的治療有著較高的應用價值及較好的發(fā)展前景。

1.外泌體所介導的腫瘤疫苗的開發(fā)：腫瘤疫苗是近年來研究的熱點之一，它是一種活性生物前體。當NSCLC細胞相關抗原刺激抗原遞呈細胞時，樹突狀細胞等抗原遞呈細胞則會產生大量攜帶有特異性癌抗原的外泌體，隨著外泌體遷移到附近區(qū)域淋巴結便可激活產生強大抗腫瘤免疫反應的CD4+和CD8+T的淋巴細胞[23]。有臨床研究證明，表皮生長因子疫苗對NSCLC的治療具有較好的療效[24]。另外也有臨床試驗證實，治療性疫苗(belagenpumatucel-L)對于NSCLC晚期患者來說可適當延長其生存期[25]。因此對于NSCLC的治療，外泌體所介導的腫瘤疫苗可提供新的思路。

2.外泌體可抑制原癌基因表達：研究發(fā)現，NSCLC相關原癌基因的表達可被外泌體有效抑制，從而對NSCLC的治療發(fā)揮作用。有研究報道，RNA干擾技術(RNA interference, RNAi)的使用能使IGF-1R、AKT1、NUPR1、WT1等肺癌相關原癌基因保持沉默，并可加速NSCLC相關miRNA的降解[26，27]。因此，通過外泌體抑制NSCLC相關致癌基因的表達也將為NSCLC的預防和治療提供新的思路。

3.降低NSCLC細胞外泌體及其內容物的含量：因NSCLC細胞分泌的外泌體及其內容物在肺癌的發(fā)生、轉移和演進中發(fā)揮著重要作用，因此減少外泌體及其內容物的含量或抑制NSCLC細胞對外泌體的分泌也可成為治療的新靶點。研究表明，NSCLC細胞分泌的外泌體能進一步分泌生存素，其可有效促進NSCLC細胞生長并抑制NSCLC細胞凋亡，生存素基因負性突變體(survivin-D53A)的使用可抑制NSCLC細胞分泌的外泌體分泌生存素，間接抑制了NSCLC細胞的生長、促進了其凋亡，有望成為潛在的基因治療藥物。Li等[28]研究發(fā)現，中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2) EPI64能有效抑制小鼠體內肺癌細胞相關外泌體的分泌，故EPI64可作為NSCLC治療的靶點。

4.外泌體可增強NSCLC患者對化療藥物的敏感度：也有一些研究證實外泌體可增強NSCLC患者對化療藥物的敏感度，如Aqil等[29]研究發(fā)現，裝載于外泌體中的植物萃取物雷公藤紅素能有效抑制肺癌細胞的增殖，同時可增強NSCLC患者對化療藥物的敏感度并減少毒性不良反應。

四、展 望

隨著人們對外泌體不斷地探索和研究發(fā)現，其在NSCLC的診療等方面有著巨大的前景和臨床應用價值，相信不久的將來便會廣泛地應用于臨床，以達到延長NSCLC患者生存時間和改善NSCLC患者生存率的目的。然而，如何尋找外泌體的靶基因、如何標記、提取、分離和純化外泌體以及如何提高外泌體對NSCLC診斷和治療的特異性及敏感度等諸多問題仍需廣大研究者不斷探究和解決。綜上所述，外泌體對NSCLC的診斷和治療擁有廣闊的前景，相信更多的外泌體研究成果能更有效、更精準地應用于臨床，以造福更多的NSCLC患者。