劉榮華，俞洪華，殷茜茜，楊 麗，邵 峰，孟曉偉*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

中藥用于疾病的預(yù)防和治療具有悠久歷史，數(shù)千年來(lái)的臨床應(yīng)用已經(jīng)證明了中藥的有效性和安全性，但是由于中藥化合物種類多、靶點(diǎn)多、藥效物質(zhì)和作用機(jī)制模糊等因素制約著中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，如何將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論用現(xiàn)代生命科學(xué)闡明一直是制約中醫(yī)藥國(guó)際化的難題[1]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的一門新興學(xué)科，通過(guò)對(duì)生物樣品(血漿，尿液，組織等)中的相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)的定性和定量分析，探索代謝物與機(jī)體生理、病理變化的相關(guān)性，以評(píng)價(jià)生物體復(fù)雜體系相互作用及對(duì)內(nèi)外因素刺激下的整體動(dòng)態(tài)代謝反應(yīng)[2]，代謝組學(xué)以其獨(dú)特的整體、動(dòng)態(tài)的表達(dá)特征與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治的診療思維不謀而合，與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑和整體性的特點(diǎn)相匹配[3]。

近些年來(lái)，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于闡明中藥的毒性機(jī)制[4]和療效[5]，其主要分析技術(shù)包括核磁共振(NMR)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)[6]和LC-MS[7]等。其中LC-MS技術(shù)在代謝組學(xué)領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橘|(zhì)譜的高靈敏度和高分辨率，并且LC-MS可以用相對(duì)較小體積(1～10 μL)的生物流體來(lái)檢測(cè)最大部分的代謝物。相比于GC-MS，LC-MS不需要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的衍生化預(yù)處理，也適用于熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)、難衍生化和分子量較大的樣品[8]。LC-MS極大推動(dòng)了代謝組學(xué)的發(fā)展，特別是高分辨質(zhì)譜憑借其高普適性、高靈敏度和準(zhǔn)確度逐漸成為代謝組學(xué)研究中的主流方法[9]。本研究以LC-MS為切入點(diǎn)，闡述了LC-MS的常用類型和生物樣品的前處理方法，并綜述了近3年來(lái)LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的具體應(yīng)用，以期為中藥代謝組學(xué)研究提供參考。

1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)梗概

LC-MS是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一門新的儀器分析方法[10]，主要由液相色譜和質(zhì)譜兩部分組成，通過(guò)LC色譜進(jìn)行分離，以MS進(jìn)行定性分析。LC-MS集LC的高分離能力、MS的高靈敏度和專屬性于一體，可以快速獲得巨大的信息量[11]。

1.1 液相色譜(Liquid chromatography，LC)

液相色譜對(duì)待測(cè)物起到分離作用，合適的色譜條件不僅可以獲得更好的檢測(cè)限，并且可以降低背景噪音獲得更高質(zhì)量的質(zhì)譜信息[12]。其中液相色譜的核心——色譜填料直接對(duì)色譜系統(tǒng)的分離效率和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響?，F(xiàn)有的色譜填料主要分為三大類：無(wú)機(jī)基質(zhì)填料、有機(jī)基質(zhì)填料和復(fù)合材料。無(wú)機(jī)基質(zhì)填料中的多孔二氧化硅微球填料，因其機(jī)械強(qiáng)度高、熱和溶劑穩(wěn)定性好、表面易于修飾和生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為應(yīng)用最廣泛的色譜填料[13]。近些年來(lái)分別有2-甲基咪唑[14]、碳量子點(diǎn)[15]、聚乙烯醇[16]、離子液體[17-18]和多孔石墨烯[19]等各種材料對(duì)二氧化硅微球進(jìn)行表面官能化修飾進(jìn)而改進(jìn)固定相和提高色譜性能，得到了很好的選擇性和分離效果。除此之外有機(jī)基質(zhì)填料中的聚合物型色譜填料憑借化學(xué)穩(wěn)定性、易于被衍生化及負(fù)載能力強(qiáng)等特點(diǎn)，也越來(lái)越受到科研工作者們的重視[20]。

如今最常用的液相色譜技術(shù)是反相液相色譜(RPLC)、親水相互作用色譜(HILIC)和正相液相色譜(NPLC)。RPLC基于疏水性的差異實(shí)現(xiàn)分離，使用RPLC可以很好地分離除極性代謝物以外的所有化合物。HILIC與RPLC互補(bǔ)，可成為強(qiáng)極性和親水性代謝物的選擇方法[21]。在利用一維液相色譜技術(shù)(1DLC)如RPLC、HILIC或NPLC分離復(fù)雜的代謝產(chǎn)物時(shí)，因?yàn)橹荒芾么x物的一種性質(zhì)，并且無(wú)法分離部分具有相似結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，所以難以在適當(dāng)分析時(shí)間內(nèi)以有限的峰容量及分離能力達(dá)到復(fù)雜樣品的分離需求。多維液相色譜技術(shù)(MDLC)中的二維液相色譜技術(shù)(2DLC)將RPLC、NPLC和HILIC等不同的分離機(jī)理的色譜柱串聯(lián)，可極大增加色譜峰容量和提高分離能力，被認(rèn)為是分析復(fù)雜樣品的有力技術(shù)[22]。2DLC分離性能是由色譜維數(shù)和分離正交性的峰容量決定，峰容量是指色譜系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)姆治鰰r(shí)間內(nèi)，相鄰色譜峰在滿足一定分離要求的基礎(chǔ)上能夠分離的最大組分?jǐn)?shù)。正交性是評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)分離能力的重要指標(biāo)，受二維色譜柱的選擇和流動(dòng)相性質(zhì)的影響[23]，正交性越高則色譜峰容量越高。理論上2DLC的峰容量是一維色譜與二維色譜分離峰容量的乘積，實(shí)際分離過(guò)程中峰容量受限于正交性程度和兩維分離的實(shí)際效率[24]。2DLC可分為在線或者離線兩種模式，離線模式一般通過(guò)傳統(tǒng)高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行，將流經(jīng)第一維的組分收集，之后再注入第二維系統(tǒng)進(jìn)行分離，同一儀器只需改變固定相和/或流動(dòng)相，即可組成一個(gè)二維液相系統(tǒng)。離線模式的優(yōu)點(diǎn)是方便且無(wú)時(shí)間限制，缺點(diǎn)則是耗時(shí)較長(zhǎng)、自動(dòng)化和重復(fù)性很差并且存在樣品丟失或者污染的風(fēng)險(xiǎn)。相比于離線模式，在線2DLC自動(dòng)化和重復(fù)性都更高并且耗時(shí)較短，第一維的組分通過(guò)特定的接口連續(xù)轉(zhuǎn)移到第二維，以便進(jìn)一步分離。在線2D-LC的峰容量通常低于離線2D-LC的峰容量，但是比1D-LC要高很多[25]。近些年來(lái)，2DLC憑借著高分離度和峰容量在代謝組學(xué)中被廣泛運(yùn)用[26-27]。

1.2 質(zhì)譜(Mass spectrometry，MS)

質(zhì)譜是通過(guò)測(cè)量化合物質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行定性定量的儀器。質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量分析器種類可分為低分辨質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜兩種，低分辨質(zhì)譜是有四極桿分析器(Quadrupole analyzer，Q)、離子阱(Ion trap，IT)、三重四極桿(Triple quadrupole，QQQ)和四極桿-線性離子阱(Q-Trap)等質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀，高分辨質(zhì)譜則有靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)、飛行時(shí)間(Time of flight，TOF)和傅立葉變換離子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)T-ICR)等[28]。

三重四級(jí)桿(QQQ)質(zhì)譜常用于定量檢測(cè)且應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，如用于藥物檢測(cè)[29]、農(nóng)藥殘留檢測(cè)[30]、抗體偶聯(lián)藥物檢測(cè)(Antibody-drug conjugates，ADCs)[31]、類固醇激素檢測(cè)[32]等。三重四級(jí)桿(QQQ)質(zhì)譜的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式定量性能高，但MRM模式需要提供特定的反應(yīng)離子信息來(lái)選擇性地采集信號(hào)，因此對(duì)未知化合物的檢測(cè)性能不足，并且MRM模式需要耗時(shí)的預(yù)篩選步驟以便為質(zhì)譜分析優(yōu)化最佳條件[33]。相對(duì)而言，Q-TOF可以無(wú)需優(yōu)化、快速可靠地鑒定和定量大多數(shù)化合物，但Q-TOF定量分析相比QQQ儀器靈敏度降低，導(dǎo)致某些目標(biāo)分析物的檢測(cè)限更高。由于電離源和離子探測(cè)器技術(shù)的改進(jìn)，最近開發(fā)的儀器提供了比過(guò)去更高的靈敏度及更寬的線性動(dòng)態(tài)范圍，近年來(lái)已經(jīng)發(fā)表了一些Q-TOF/MS定量分析的研究[33-36]。Q-Trap可以通過(guò)子離子掃描(Product Ion Scan)、母離子掃描(Precursor Ion Scan)和中性碎片丟失掃描(Neutral Loss)等掃描模式用于定量和定性分析，使用比較多的是通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描 MRM模式進(jìn)行定量檢測(cè)和線性離子阱的增強(qiáng)子離子掃描模式 (Enhanced product ion scanning，EPI)獲得相應(yīng)的二級(jí)碎片圖進(jìn)行定性確證。當(dāng)使用信息依賴性獲取技術(shù) (Information dependent acquisition，IDA)時(shí)，可將兩種掃描模式相結(jié)合，即多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描模式 (MRM-IDA-EPI)，該種模式一次進(jìn)樣可以同時(shí)獲得高靈敏度MRM的定量數(shù)據(jù)和二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖 (EPI)進(jìn)行定性確認(rèn)[37-39]，在不降低定性和定量分析性能的同時(shí)，不僅實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量特定目標(biāo)化合物，而且只需一次進(jìn)樣就能準(zhǔn)確定性鑒定化合物。FT-ICR具有超高的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度、多級(jí)裂解和不需要色譜分離直接進(jìn)樣進(jìn)行代謝物檢測(cè)和鑒定等特點(diǎn)，可以更有效準(zhǔn)確地鑒定內(nèi)源代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此近些年來(lái)在代謝組學(xué)研究中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)[40]，盡管FT-ICR具備了超高的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度，但TOF在廣泛的采樣率范圍內(nèi)更加穩(wěn)定，在高采樣率下，TOF的靈敏度可能超過(guò)FT-ICR[41]。由四極桿分析器(Quadrupole analyzer，Q)和軌道阱(Orbitrap)組成的串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-Orbitrap)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)母離子和質(zhì)譜二級(jí)碎片離子的高分辨數(shù)據(jù)采集，為化合物的鑒定提供了準(zhǔn)確的信息，具有高靈敏度、高分離度和高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛運(yùn)用于中藥成分研究[42-44]。

2 生物樣品的前處理

在代謝組學(xué)的檢測(cè)分析中，往往需要生物樣品作為分析目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，生物樣品往往含有除了待測(cè)組分以外的許多干擾檢測(cè)內(nèi)源性或外源性的物質(zhì)，對(duì)質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生增強(qiáng)或者抑制等基質(zhì)效應(yīng)[45]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在眾多生物基質(zhì)中，磷脂等分子是基質(zhì)效應(yīng)的主要來(lái)源[45-46]，其他成分如鹽類對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)也有很強(qiáng)的影響，尤其是在這些物質(zhì)不易揮發(fā)的情況下[47]。因?yàn)樯飿悠分写郎y(cè)組分的含量很低，因此想要提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度必須采取方法減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。樣品前處理可以有效減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，樣品前處理的方法有蛋白沉淀法、固相萃取法、液液萃取法、微透析技術(shù)和其他方法。

2.1 蛋白沉淀法(Protein precipitation，PPT)

藥物在體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程中，藥物的原型成分與代謝成分均可與內(nèi)源性蛋白形成蛋白結(jié)合物，為了檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度的需要，必須使藥物從蛋白結(jié)合物中分離。蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)是目前使用最廣泛、簡(jiǎn)單的樣品前處理方法，一般步驟是向樣品中加入有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇等)、無(wú)機(jī)鹽和酸性物質(zhì)，或者采用加熱的方法使蛋白沉淀，然后高速離心分離得到待測(cè)液。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單快速、成本低廉，但是因?yàn)闊o(wú)法消除大部分不參與蛋白質(zhì)沉淀的內(nèi)源性成分[48]，因此靈敏度較低且不適合微量樣品的分析。

2.2 固相萃取法(Solid phase extraction，SPE)

固相萃取法基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、凈化，可看作一種類似色譜過(guò)程。根據(jù)固相萃取劑的不同固相萃取法可分為正相、反相和離子交換固相萃取三類。固相萃取法的基本操作步驟有三步：活化、上樣和洗脫，其優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度高，選擇性好；缺點(diǎn)主要是成本較高，重現(xiàn)性比較差。因此為了取得更好的檢測(cè)效果，減少基質(zhì)效應(yīng)的影響需要采取更為復(fù)雜的處理方法，比較常用的是混合SPE的方法[49-51]。

2.3 液液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)

液液萃取法利用的是萃取的原理，因?yàn)榇蟛糠炙幬锒际怯H脂性的，血漿樣品中大部分內(nèi)源性物質(zhì)都是極性較大的水溶性物質(zhì)。通過(guò)加入與水不相溶的有機(jī)溶劑如(乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿等)，可將親脂性藥物萃取出來(lái)富集之后進(jìn)行檢測(cè)。液液萃取法操作簡(jiǎn)單，成本較低，但是極性化合物的提取率很差，且自動(dòng)化程度較低。

2.4 微透析技術(shù)(Microdialysis technology，MD)

微透析技術(shù)是基于透析原理的活體取樣技術(shù)，近些年來(lái)越發(fā)受到人們的關(guān)注，該技術(shù)可以在維持生物生命體征正常的情況下進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)和在線取樣和檢測(cè)。微萃取系統(tǒng)主要由微量注射泵、探針、微量收集器、連接管和分離檢測(cè)裝置組成。一般操作步驟是將探針探入靶組織，微量注射泵將灌流液(濃度、組成與靶組織間液相似的生理溶液)以一定流速(一般1～5 μL /min)流經(jīng)探針，此時(shí)由于半透膜兩端藥物有濃度差，游離型藥物會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入探針隨著灌流液不斷流出。探針是該系統(tǒng)的核心部分，起著半透膜的作用，目前常用的探針有柔性探針、同心圓形探針、線性探針和分流探針?biāo)姆N，可以根據(jù)不同的靶組織選擇不同的探針。與其他方法相比，微透析技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)[52-53]：①對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害較小，取樣過(guò)程不影響生物正常生命體征，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線取樣；②可以在同一動(dòng)物身上連續(xù)取樣，減少動(dòng)物使用量，降低個(gè)體差異帶來(lái)的影響；③自動(dòng)篩選游離型藥物，由于探針半透膜的存在使得灌流液中的樣品無(wú)需直接檢測(cè)，減少了樣品的損失和誤差，提高了樣品穩(wěn)定性。雖然微透析技術(shù)能夠完全除去蛋白質(zhì)和其他大分子，但是依然無(wú)法除去鹽類物質(zhì)[48]，應(yīng)通過(guò)其他樣品制備技術(shù)或適當(dāng)?shù)纳V分離來(lái)消除鹽類物質(zhì)[54]。

2.5 其他方法

在生物樣品的前處理方法中還有其他的處理方法，比如液相微萃取(Liquid phase microextraction，LPME)[55]、固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)[56-57]、分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology，MIT)[58]、柱切換技術(shù)(Column switching technology，CS)[59]和超臨界流體萃取(Supercriticalfluid extraction，SFE)[60]等方法。為了提高樣品前處理的質(zhì)量，以上所有方法也可以互相結(jié)合起來(lái)[61]。

3 LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)中一個(gè)快速發(fā)展領(lǐng)域，代謝組學(xué)通過(guò)分析生物樣品中的整體代謝情況，研究體內(nèi)內(nèi)源性代謝物應(yīng)對(duì)外部刺激的潛在生物標(biāo)志物和代謝途徑，揭示病理機(jī)制和藥物療效機(jī)制。代謝組學(xué)的整體性和動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥理論的整體性和統(tǒng)一性原則相契合，為中藥疾病診斷、藥物評(píng)價(jià)和機(jī)制解釋提供了一種有前景的方法。中藥的多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)對(duì)于中藥的分析技術(shù)提出了很高的要求。近些年來(lái)，LC-MS憑借高靈敏度和準(zhǔn)確度以及分析效率高等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為中藥代謝組學(xué)領(lǐng)域的主要方法，LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的應(yīng)用主要有單味中藥研究、中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究、生物標(biāo)志物研究和中藥復(fù)方作用機(jī)制研究等四個(gè)方面，生物樣品的選取也從傳統(tǒng)的血清、尿液和糞便樣品擴(kuò)展到了組織、細(xì)胞等樣品。見表1。

3.1 單味中藥研究

單味中藥是中醫(yī)預(yù)防和治療疾病的最主要載體，也可以看作是一個(gè)小復(fù)方，對(duì)單味中藥的研究不僅關(guān)乎中藥的臨床療效和合理用藥，也可以為中藥資源的合理應(yīng)用提供依據(jù)。劉子菡等[62]基于代謝組學(xué)技術(shù)研究硫熏麥冬影響大鼠體內(nèi)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的相關(guān)過(guò)程，應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)空白組、麥冬提取物組和硫熏麥冬提取物組的SD大鼠血漿樣本進(jìn)行分析，篩選和鑒定出35 個(gè)差異性生物標(biāo)志物和15個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，通過(guò)對(duì)大鼠血漿生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析，得到6條代謝通路，結(jié)果顯示硫熏麥冬組主要影響了大鼠體內(nèi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路，推斷硫熏麥冬擾亂了正常大鼠體內(nèi)氨基酸的生物合成及代謝相關(guān)過(guò)程。該研究不僅為硫熏麥冬的毒性機(jī)理提供了科學(xué)解釋，也為硫磺熏蒸法炮制的中藥研究提供了參考。王夏雷等[63]通過(guò)分析大鼠空白組和土三七給藥組血清、肝組織差異代謝通路，從多方面揭示土三七致肝毒性的作用機(jī)制；將大鼠連續(xù)給藥14天后處死，取血和肝臟組織測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、白蛋白 (ALB)水平，并通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用法分析大鼠代謝譜變化；發(fā)現(xiàn)與空白組相比，土三七給藥組的ALT和AST水平顯著升高，并分別從血清和肝臟組織中篩選出13種和14種差異代謝物，推斷土三七致肝毒性機(jī)制可能與甘油磷脂、膽汁酸代謝紊亂有關(guān)；該研究利用代謝組學(xué)方法從內(nèi)源性代謝物變化角度初步探討了土三七致大鼠肝毒性的毒性機(jī)理，為毒性中藥的毒性機(jī)制研究提供了一種新的視角。除此之外，植物代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要組成部分，植物代謝組學(xué)也逐漸成為中藥資源領(lǐng)域研究的有效途徑[91]。WU等[64]基于植物代謝組學(xué)方法對(duì)虎杖的6個(gè)不同部位組織(根、莖、葉、花、根莖和種子)的代謝譜進(jìn)行了分析檢測(cè)，鑒定了虎杖的主要活性成分二苯乙烯類化合物、蒽醌類化合物和黃酮類化合物，并測(cè)定了各組織間化合物的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)根和根莖中二苯乙烯類和恩醌類化合物的含量遠(yuǎn)高于其他組織，為虎杖的傳統(tǒng)根與根莖入用藥提供了科學(xué)依據(jù)；并且篩選了13個(gè)化合物作為鑒別虎杖不同組織的潛在化學(xué)標(biāo)志物，為虎杖不同組織的不同用途提供了化學(xué)依據(jù)，對(duì)虎杖藥材資源的進(jìn)一步開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

3.2 中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究

中藥在臨床應(yīng)用中常以單味藥成方或以四氣五味、君臣佐使等藥性搭配成為中藥復(fù)方來(lái)發(fā)揮最佳療效，數(shù)千年的實(shí)際運(yùn)用已證實(shí)中藥復(fù)方的療效和安全性，但是由于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和療效機(jī)制仍未明了，嚴(yán)重限制了中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化，代謝組學(xué)的出現(xiàn)為闡明中藥復(fù)方配伍的科學(xué)性提供了一種強(qiáng)有力的方法。

當(dāng)歸四逆湯(DSD)是我國(guó)傳統(tǒng)治療血虛寒厥、溫血養(yǎng)經(jīng)的名方，由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、通草、甘草和大棗七味藥組成，其中當(dāng)歸和桂枝為君藥起到溫經(jīng)驅(qū)寒、活血化瘀等作用，白芍和細(xì)辛為臣藥，甘草和大棗能減輕細(xì)辛、桂枝的副作用，通草能通絡(luò)活血均作為輔助用藥。由于血虛寒厥證病理的復(fù)雜性和當(dāng)歸四逆湯組成的多樣性，使得對(duì)其療效機(jī)制及其配伍規(guī)律的研究比較困難。WU等[70]將48只大鼠分為對(duì)照組、模型組、當(dāng)歸四逆湯組、除去君藥組(NJ)、除去臣藥組(NC)、除去輔助用藥組(NZ)6組，連續(xù)給藥2周后取血進(jìn)行分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)DSD組的全血黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低，這兩項(xiàng)指數(shù)評(píng)價(jià)DSD對(duì)于血瘀證的治療效果最好；然后使用UPLC-Q-TOF/MS法對(duì)血清樣品在正負(fù)離子模式下的代謝譜進(jìn)行分析，得到結(jié)論：經(jīng)DSD及治療后，血瘀證模型大鼠的代謝特征趨向于對(duì)照組，篩選出20種成分作為血瘀證的潛在生物標(biāo)志物并鑒定出13種代謝物；給藥DSD后9種生物標(biāo)志物被調(diào)節(jié)(2種未鑒定)，調(diào)節(jié)途徑主要是調(diào)控了甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成和丙酮酸代謝的功能障礙；NJ組對(duì)血瘀證有一定的治療效果，但與DSD組相比有5種代謝物均未被調(diào)節(jié)，表明君藥當(dāng)歸和桂枝組調(diào)節(jié)的是異常的甘油磷脂代謝和花生四烯酸代謝；NC組對(duì)血瘀證有一定的治療效果，但與DSD組相比有5種代謝物未被調(diào)控，表明臣藥白芍和細(xì)辛主要調(diào)控的是甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝和丙酮酸代謝的失調(diào)；NZ組相比于DSD組有5種代謝物未被調(diào)節(jié)，表明輔助用藥通草、大棗和甘草調(diào)節(jié)了甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝和丙酮酸代謝。以上結(jié)果顯示DSD對(duì)血瘀證的療效均優(yōu)于其他組，并且通過(guò)多種中藥和多種活性成分同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)，證實(shí)了中藥的君臣佐使理念的正確性。該方法利用代謝組學(xué)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)了血瘀證相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并使用拆方法來(lái)揭示DSD的各味藥的協(xié)同作用和調(diào)控機(jī)制，證實(shí)了代謝組學(xué)是闡明中藥復(fù)方配伍規(guī)律的有效方法。甘遂-甘草是2000年前中藥理論“中藥十八反”之一，因?yàn)樗鼈兒嫌脮r(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性，而中藥方劑甘遂半夏湯包含了甘遂和甘草以及半夏和芍藥共四味藥，CUI等[76]從代謝組學(xué)的角度研究了甘遂-甘草配伍對(duì)肝、腎毒性的作用及甘遂半夏湯的減毒作用；共鑒定甘遂甘草肝毒性和腎毒性生物標(biāo)志物20種，芍藥的添加通過(guò)磷脂代謝、脂肪酸代謝、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝和磷酸肌醇代謝途徑減弱了配伍不相容中藥甘遂-甘草的肝毒性和腎毒性，證明了甘遂半夏湯的減毒作用。馬榮等[77]基于代謝組學(xué)方法研究厚樸遠(yuǎn)志配伍對(duì)大鼠尿液中代謝物的影響，借以探討厚樸緩解遠(yuǎn)志所致胃腸動(dòng)力障礙的療效機(jī)制，共鑒定出16個(gè)特征代謝標(biāo)志物并對(duì)特征代謝標(biāo)志物進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸代謝、色氨酸代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成和維生素B6可能是厚樸配伍遠(yuǎn)志緩解遠(yuǎn)志所致胃腸動(dòng)力障礙的主要相關(guān)代謝通路。

3.3 生物標(biāo)志物研究

生物體是一個(gè)統(tǒng)一和動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)，其體內(nèi)的代謝系統(tǒng)會(huì)保持在一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。運(yùn)用代謝組學(xué)平臺(tái)可以定量檢測(cè)生物體內(nèi)的代謝情況變化，鑒定證候相關(guān)的生物標(biāo)志物并確定其所涉及的代謝通路。陰虛證(YDS)是一種中醫(yī)學(xué)常見的亞健康狀態(tài)，病因復(fù)雜。YU等[80]應(yīng)用代謝組學(xué)方法分析健康對(duì)照組、YDS組和知母治療組三組大鼠血清代謝產(chǎn)物，比較發(fā)現(xiàn)YDS大鼠處于高能量消耗狀態(tài)，其雄性激素、免疫系統(tǒng)活性和能量代謝均顯著增加，并鑒定了6種代謝物作為YDS的潛在生物標(biāo)志物，為YDS的診斷和治療提供了參考。LIN等[83]基于代謝組學(xué)平臺(tái)，使用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)脾陽(yáng)虛證(SYDS)患者和健康志愿者的血漿代謝譜進(jìn)行了比較分析，共成功鑒定出15個(gè)代謝物作為SYDS的潛在生物標(biāo)志物，分析結(jié)果表明SYDS患者存在明顯的亞油酸代謝紊亂情況導(dǎo)致的能量代謝障礙，還可能存在如花生四烯酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及類固醇激素合成等代謝紊亂，為 SYDS的診斷和理解SYDS病理機(jī)制提供了一種方法。使用代謝組學(xué)方法研究傳統(tǒng)中醫(yī)證候發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物，為中醫(yī)證候的診斷及中藥方劑療效評(píng)價(jià)提供了新的方法，也為中醫(yī)治療提供了新的靶點(diǎn)。

3.4 中藥復(fù)方作用機(jī)制研究

從古至今，在中醫(yī)的臨床治療中常常使用中藥復(fù)方進(jìn)行治療，因此研究治療病證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和療效機(jī)制必須以完整的中藥復(fù)方進(jìn)行研究。DU等[84]通過(guò)連續(xù)20天給雄性大鼠腹腔注射氫化可的松建立腎陽(yáng)虛證模型，研究大鼠腎上腺和睪丸組織的代謝譜以探討龜齡集對(duì)于腎陽(yáng)虛證大鼠的治療作用，從腎上腺組織中和睪丸組織中分別確定了19種和31種代謝物作為腎陽(yáng)虛證大鼠的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)服用龜齡集后，大鼠的體重、行為指標(biāo)和生化指標(biāo)較模型組增加，腎上腺和睪丸組織的形態(tài)異常得到了改善，發(fā)現(xiàn)龜齡集通過(guò)調(diào)節(jié)類固醇激素的生物合成、抗氧化劑和抗氧化劑的平衡以及能量的獲取起到對(duì)腎陽(yáng)虛證大鼠的保護(hù)作用。WU等[85]通過(guò)綜合代謝組學(xué)研究麝香保心丸(SBP)對(duì)急性心肌梗死(AMI)大鼠模型的潛在保護(hù)機(jī)制，通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立AMI大鼠模型，分析給藥SBP后的大鼠血清、尿液、糞便和心臟組織代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)不同組織的代謝譜存在顯著差異，共鑒定出217種代謝產(chǎn)物，AMI引起氨基酸代謝、甘油磷脂代謝和嘧啶代謝的全面代謝變化，SBP逆轉(zhuǎn)了一半以上的差異代謝變化，主要影響氨基酸代謝、丁酸代謝和甘油磷脂代謝，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SBP可顯著改變AMI相關(guān)的6種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物(5-羥基吲哚乙酸、甘油磷酸膽堿、PS(20∶4/0∶0)、黃嘌呤核苷、腺苷和L-苯丙氨酸)的代謝活性，表明SBP可通過(guò)調(diào)節(jié)氨基酸、脂質(zhì)和能量代謝途徑有效保護(hù)心臟功能。馮彥等[86]基于16S rRNA基因測(cè)序和代謝組學(xué)方法，探討逍遙散低極性部位對(duì)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激 (CUMS)大鼠的抗抑郁作用機(jī)制，一共從盲腸內(nèi)容物中鑒定出20種抑郁癥的生物標(biāo)志物，逍遙散低極性部位干預(yù)后可回調(diào)17種，涉及的通路為亞油酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x、初級(jí)膽汁酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝，并且顯著回調(diào)了CUMS模型大鼠腸道微生物中羅思氏菌屬 (Rothia)、普雷沃氏菌屬 (Prevotella)等腸道菌群，推斷逍遙散低極性部位可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的組成及盲腸內(nèi)容物的代謝物及通路發(fā)揮抗抑郁作用。中藥代謝組學(xué)為中醫(yī)證候的客觀診斷、療效評(píng)價(jià)和作用機(jī)制闡明提供了一種新的視角，成為了國(guó)際上研究中藥復(fù)方的通用方法。

4 總結(jié)與展望

中藥被運(yùn)用于臨床的預(yù)防和治療時(shí)，往往因其多靶點(diǎn)、多成分等特性給藥效機(jī)制研究帶來(lái)困難。中藥代謝組學(xué)以“中藥-證候-生物標(biāo)志物-藥效機(jī)制”的對(duì)應(yīng)關(guān)系從生物體整體的角度出發(fā)，通過(guò)對(duì)體內(nèi)總體代謝物的分析來(lái)揭示疾病的生物標(biāo)志物及病理機(jī)制和中藥及中藥復(fù)方的藥效機(jī)制[92]，用現(xiàn)代科學(xué)方法解釋了傳統(tǒng)中藥的藥效機(jī)理和配伍規(guī)律，為中醫(yī)藥國(guó)際化提供了一個(gè)重要的方法。

從目前的應(yīng)用來(lái)看，LC-MS技術(shù)已廣泛用于中藥代謝組學(xué)中并以分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)得到越來(lái)越多研究者的認(rèn)可。目前比較先進(jìn)的LC-MS技術(shù)(如UPLC-Q-TOF-MS)尤其適用于多種化學(xué)成分的非靶向化合物和未知化合物篩選，為探索中藥多組分活性成分的協(xié)同作用、藥物在分子水平上發(fā)揮藥效的機(jī)制提供了可能。從目前的應(yīng)用來(lái)看，該方法還存在著如下的一些不足：①實(shí)際測(cè)定時(shí)由于不同實(shí)驗(yàn)室使用的實(shí)驗(yàn)條件的差異，即使差異相對(duì)較小會(huì)導(dǎo)致液相色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜圖的重復(fù)性差[93]，因此對(duì)化合物的鑒定是LC-MS的難題之一；②大樣本的代謝組學(xué)研究需要更加快速、穩(wěn)定、重復(fù)性更高的分析方法，從而更加準(zhǔn)確地定性定量分析代謝譜；③微量樣本的代謝組學(xué)研究需要發(fā)展超高靈敏度的檢測(cè)方法以實(shí)現(xiàn)代謝物的廣泛覆蓋；④準(zhǔn)確定性的代謝物仍需結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過(guò)對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合才能獲得所傳達(dá)出的生物學(xué)信息。對(duì)以上存在的不足進(jìn)行改良和創(chuàng)新會(huì)是LC-MS技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，代謝物與機(jī)體整體的功能狀態(tài)之間的聯(lián)系也會(huì)被人們更加了解。伴隨LC-MS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和成本降低以及代謝組學(xué)研究的更加完善，將LC-MS技術(shù)與中藥代謝組學(xué)更有機(jī)地結(jié)合起來(lái)會(huì)成為促進(jìn)中藥現(xiàn)代化的重要方法。