陸定貴

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科，廣西百色市 533000)

軟骨組織由軟骨細(xì)胞和基質(zhì)構(gòu)成，缺乏神經(jīng)、血管，損傷后自愈能力差，易發(fā)生創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肢體殘疾[1]。目前臨床上治療軟骨損傷常用的方法有自體或異體軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換等[2]。自體軟骨可移植的數(shù)量有限，無(wú)法滿(mǎn)足大面積缺損患者，而同種異體移植常常有較強(qiáng)的排斥反應(yīng)，療效欠佳。人工關(guān)節(jié)雖然在力學(xué)上已接近正常關(guān)節(jié)，但存在假體松動(dòng)、使用壽命短等缺陷。組織工程學(xué)是一門(mén)與細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)緊密相關(guān)的學(xué)科，通過(guò)組織工程技術(shù)將細(xì)胞與材料有機(jī)結(jié)合，構(gòu)建出有生命力的活體組織來(lái)修復(fù)病損，以達(dá)到與正常組織生物特性最大化的相似[3]。組織工程的研究?jī)?nèi)容主要包括種子細(xì)胞、細(xì)胞因子、支架材料。組織工程的概念興起以來(lái)，有關(guān)學(xué)者一直在嘗試運(yùn)用組織工程技術(shù)來(lái)修復(fù)軟骨缺損。軟骨組織工程的目的是模擬軟骨修復(fù)的自然過(guò)程，通過(guò)對(duì)種子細(xì)胞、支架、細(xì)胞生物活性物質(zhì)等的調(diào)控，促進(jìn)軟骨組織愈合[4]?，F(xiàn)對(duì)軟骨組織工程的相關(guān)研究作一綜述，并探討間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)修復(fù)軟骨缺損的臨床應(yīng)用策略。

1 種子細(xì)胞的研究現(xiàn)狀

細(xì)胞是組織工程中最重要的組成部分，軟骨組織工程中常用的細(xì)胞有軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、多能干細(xì)胞。

1.1 軟骨細(xì)胞 軟骨細(xì)胞是軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞，具有直接分泌外基質(zhì)能力，同時(shí)來(lái)源充足、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、植入后細(xì)胞成活率高，是軟骨組織工程修復(fù)中理想的種子細(xì)胞[5]。軟骨細(xì)胞來(lái)源于自體正常軟骨，其制作方法為，將獲得的軟骨組織切成小塊，并在37 ℃的Ⅱ型膠原酶中消化過(guò)夜。消化后，收集釋放的細(xì)胞并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，以獲取足夠的細(xì)胞用于組織工程。軟骨細(xì)胞的主要缺陷在于取材時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致新的傷害。同時(shí)，獲取的軟骨細(xì)胞在擴(kuò)增傳代過(guò)程中去分化明顯，逐漸失去其特征并顯示出成纖維細(xì)胞樣特征。但是，已有研究表明，水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)去分化軟骨細(xì)胞的再分化[6]。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs來(lái)源于中胚層，存在于骨髓和脂肪中，具有多向分化潛能和自我更新能力，是細(xì)胞治療的重要工具。MSCs在軟骨組織工程中具有多種優(yōu)勢(shì)[7]。首先，與軟骨細(xì)胞不同，MSCs可以快速生長(zhǎng)并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持其特性。其次，MSCs能通過(guò)損傷部位釋放的信號(hào)因子來(lái)定位損傷部位，隨后趨化、遷移至損傷區(qū)域，并分化為多種相關(guān)的譜系，通過(guò)旁分泌活性調(diào)節(jié)炎癥和血管生成，直接分化為軟骨細(xì)胞修復(fù)病損軟骨。此外，MSCs產(chǎn)生多種對(duì)軟骨功能至關(guān)重要的基質(zhì)分子，包括膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖以及各種細(xì)胞因子。

1.3 多能干細(xì)胞 最近關(guān)于胚胎干細(xì)胞軟骨分化的研究報(bào)道吸引了研究者的注意[8]。胚胎干細(xì)胞具有無(wú)限的自我更新功能和分化成幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型的能力，可為組織工程修復(fù)提供充足的種子細(xì)胞，但胚胎干細(xì)胞的軟骨分化需要復(fù)雜的程序，同時(shí)存在倫理道德問(wèn)題[9]。為了避免胚胎干細(xì)胞的倫理問(wèn)題，可以通過(guò)重編程體細(xì)胞，將其誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞[10]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞已經(jīng)在動(dòng)物模型上被證明具有成軟骨能力，但是在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的生物安全性方面仍有待研究。

2 支架材料

支架在軟骨組織工程中的作用包括提供結(jié)構(gòu)支持、增強(qiáng)軟骨形成和指導(dǎo)軟骨再生。支架可分為天然支架和合成聚合物支架。理想的支架材料應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：(1)良好的生物相容性，對(duì)宿主無(wú)毒，無(wú)免疫排斥反應(yīng)；(2)支架可降解性及其降解速率可控性，降解的產(chǎn)物相對(duì)無(wú)毒性；(3)支架自身有利于細(xì)胞的黏附、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌；(4)良好的可塑性及一定的機(jī)械強(qiáng)度[11]。聚羥基乙酸、MSCs及軟骨衍生的細(xì)胞外基質(zhì)、水凝膠、羥基磷灰石、聚羥基烷酸酯是組織工程常常應(yīng)用的人工可降解支架材料[12]。

目前，已有許多天然和合成聚合物被用在軟骨組織工程支架研發(fā)中。天然聚合物(如膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素)具有出色的生物相容性和生物降解性，適合啟動(dòng)快速再生過(guò)程[13]。但是，天然聚合物潛在的病原體傳播、免疫原性和機(jī)械性能較差限制了其臨床應(yīng)用。而合成的聚合物可以人為地調(diào)節(jié)聚合度，從而控制其機(jī)械性能、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和降解，可以有效地促進(jìn)再生過(guò)程[14]。聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙交酯-乙醇酸和聚己內(nèi)酯是三維支架用于軟骨組織工程中最常用的聚合物[15]。

組織工程支架的適用性由許多相關(guān)因素決定。生物材料應(yīng)具有生物相容性和細(xì)胞啟發(fā)性，具有多孔性和孔隙連通性，有利于細(xì)胞遷移和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及組織廢物的運(yùn)輸。對(duì)于承重組織的工程，支架需要具有特定的機(jī)械性能和確保機(jī)械刺激轉(zhuǎn)移到細(xì)胞以指導(dǎo)其分化。實(shí)現(xiàn)這些設(shè)計(jì)目標(biāo)是具有挑戰(zhàn)性的，但或許可以通過(guò)集成計(jì)算工具如有限元建模與三維打印技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，以評(píng)估支架結(jié)構(gòu)和材料特性如何影響植入物的性能。但這需要探索不同纖維直徑、間距和放置方式對(duì)生物支架的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的影響[16]。

3 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是軟骨組織工程的三要素之一，良好的細(xì)胞因子對(duì)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞具有極佳的生物相容性，可促進(jìn)干細(xì)胞趨化、黏附、定植、增殖、分化為軟骨細(xì)胞并分泌軟骨基質(zhì)。軟骨組織工程修復(fù)過(guò)程是由多種細(xì)胞因子之間共同作用的結(jié)果，目前研究較為深入的細(xì)胞因子主要有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)家族和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(bone morphogenetic protein，BMP)[17]。

TGF-β由兩條相同或相似的肽鏈組成，分子量為25 kDa。TGF-β是間充質(zhì)前體細(xì)胞軟骨形成的主要引發(fā)劑之一，并且MSCs向軟骨細(xì)胞的分化也需要其刺激。同時(shí)，TGF-β具有誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖和合成Ⅱ型膠原蛋白的功能[18]。TGF-β有三種同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，其促進(jìn)軟骨分化的能力沒(méi)有顯著差異，并且TGF-β促進(jìn)軟骨形成分化主要取決于第一周的刺激程度[19]。

IGF有IGF-1和IGF-2兩個(gè)亞型。研究證明IGF的兩個(gè)亞型均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，刺激軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)軟骨修復(fù)有益[20]。特別重要的是，IGF-1能夠獨(dú)立地誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化。與單獨(dú)使用IGF-1相比，將IGF-1和TGF-β1協(xié)同使用對(duì)透明質(zhì)軟骨的形成具有更好的作用，并出現(xiàn)改善的細(xì)胞排列[21]。此外，IGF-1和BMP-2協(xié)同使用時(shí)可促使分化后的細(xì)胞高表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白、降低基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)[22]。而IGF-1與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合用于體內(nèi)軟骨修復(fù)和最佳遞送策略仍有待充分闡明。

FGF與軟骨細(xì)胞增殖、基質(zhì)合成、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。FGF-2是FGF家族最受關(guān)注的代表性成員。在體外環(huán)境中，F(xiàn)GF-2上調(diào)MSCs的SOX9基因表達(dá)水平，從而通過(guò)啟動(dòng)軟骨分化機(jī)制加速細(xì)胞分化[23]。有研究將FGF-2摻入纖維蛋白凝塊并植入軟骨損傷處，證明了其可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的再生修復(fù)。但是，F(xiàn)GF-2與BMP-6或TGF-β組合時(shí)會(huì)抑制后者誘導(dǎo)軟骨分化的能力[24]。因此，F(xiàn)GF與其他生長(zhǎng)因子在軟骨形成分化過(guò)程中的相互作用尚待進(jìn)一步研究。

PDGF對(duì)間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞具有有效的促有絲分裂和趨化作用。PDGF-BB干預(yù)的軟骨細(xì)胞以劑量依賴(lài)性方式顯著增加，并且增強(qiáng)了軟骨基質(zhì)的產(chǎn)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[25]，PDGF可顯著增強(qiáng)兔子模型中軟骨缺損部位的透明軟骨再生。機(jī)制可能是PDGF上調(diào)了一種與細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移有關(guān)的蛋白(G蛋白偶聯(lián)受體激酶互作蛋白1)，隨后促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖和遷移。然而，在人軟骨細(xì)胞中加入PDGF會(huì)刺激去分化相關(guān)基因的表達(dá)，因此，需要進(jìn)一步評(píng)估PDGF在軟骨組織工程學(xué)中的益處。

BMP是TGF-β超家族的成員，因此也可以通過(guò)TGF-β經(jīng)典的Smad和非Smad途徑誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，形成軟骨并促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成[26]。目前已有許多BMP的亞型被發(fā)現(xiàn)，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7在軟骨組織工程領(lǐng)域的研究最廣泛。BMP-2在整個(gè)軟骨形成過(guò)程中都高度表達(dá)。因此，其已普遍用于改善體外和體內(nèi)軟骨的再生。但BMP不同亞型誘導(dǎo)軟骨再生的能力仍然存在爭(zhēng)議，大多數(shù)BMP還可誘導(dǎo)成骨，由此引起的異位骨化是一個(gè)重要的問(wèn)題，需要進(jìn)一步研究并加以克服。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)策略

軟骨組織工程常用的種子細(xì)胞是MSCs和自體軟骨細(xì)胞。MSCs易于從組織中分離，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，且具有很強(qiáng)的成軟骨潛能，成為軟骨組織工程中最具修復(fù)能力的種子細(xì)胞[27]。廣泛的臨床前試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，MSCs在軟骨分化因子的作用下可以分化為軟骨組織，可修復(fù)受損的軟骨。

用于軟骨修復(fù)的MSCs可以從外源性獲取或內(nèi)源性獲取。內(nèi)源性獲取MSCs主要是通過(guò)微骨折手術(shù)，采用克氏針在軟骨下骨板上鉆孔，以打通軟骨下骨髓腔，通過(guò)炎癥作用，刺激骨髓腔里的MSCs趨化、定植于損傷區(qū)[28]。外源性獲取MSCs是通過(guò)宿主的其他組織獲得MSCs，然后通過(guò)手術(shù)切口或關(guān)節(jié)內(nèi)注射植入關(guān)節(jié)中，以進(jìn)行小規(guī)模的軟骨修復(fù)。不論MSCs是外源性或內(nèi)源性來(lái)源，都需要趨化、遷移、定植于損傷區(qū)，才能發(fā)揮細(xì)胞代謝功能、修復(fù)作用，這一過(guò)程稱(chēng)為“歸巢”。

組織修復(fù)過(guò)程需要有足夠數(shù)量的細(xì)胞歸巢到靶組織。然而，不論是外源還是骨髓遷移途徑，僅有小部分移植細(xì)胞能到達(dá)靶組織，且移植細(xì)胞存活率極低[29]。歸巢包括非系統(tǒng)歸巢和系統(tǒng)歸巢。非系統(tǒng)歸巢是指細(xì)胞在靶組織內(nèi)移植，然后通過(guò)趨化因子濃度梯度引導(dǎo)到靶組織；系統(tǒng)歸巢是移植細(xì)胞被管理或內(nèi)源性招募到血液中，經(jīng)過(guò)多步驟的過(guò)程，以退出循環(huán)和遷移到損傷部位。研究表明[30]，經(jīng)外周靜脈移植的干細(xì)胞在移植15 min后有80%存在于肺組織。4 d后，移植細(xì)胞呈指數(shù)下降至0.01%。另外，介于損傷區(qū)域自由基產(chǎn)生、免疫炎性反應(yīng)等，趨化遷移來(lái)的移植干細(xì)胞約7 d內(nèi)凋亡[31]。MSCs雖然具有修復(fù)受損組織、儲(chǔ)存生長(zhǎng)因子和再生分子的能力，然而MSCs歸巢效率低下，歸巢消耗是實(shí)現(xiàn)MSCs完全治療潛力的主要瓶頸[32]。

MSCs治療所面臨的最大挑戰(zhàn)之一是提高其歸巢效率。MSCs的歸巢機(jī)制目前已知其涉及滾動(dòng)、激活、俘獲、穿越、遷移等步驟[33]，但尚不清楚哪些步驟是MSCs消減的主要瓶頸。目前已采取多種方法來(lái)改進(jìn)MSCs歸巢。這些策略可大致分為七種：(1)靶向給藥；(2)磁引導(dǎo)；(3)基因修飾；(4)細(xì)胞表面工程；(5)體外啟動(dòng)；(6)靶組織的修飾；(7)放射治療技術(shù)[34]。這些策略中有一些側(cè)重于非系統(tǒng)性歸巢，如靶向給藥和磁引導(dǎo)。每種方法都有自己的缺點(diǎn)，而且因靶組織的不同，靶向給藥的作用有限。對(duì)MSCs的修飾也并不能完全阻止其分布到非靶器官。另一方面，通過(guò)化學(xué)或基因手段改變靶組織會(huì)引起安全問(wèn)題。目前也有觀點(diǎn)認(rèn)為利用超聲增強(qiáng)MSCs歸巢是一個(gè)有效途徑，可以很容易地進(jìn)入靶向深部和淺部器官，但這一觀點(diǎn)仍需更多的研究支撐。

雖然歸巢可能是實(shí)現(xiàn)MSCs療法的主要障礙，但其他障礙也同樣存在。在臨床設(shè)置中使用的MSCs來(lái)源于健康的供體，盡管這些細(xì)胞在定義表面標(biāo)記的表達(dá)中可能是均質(zhì)的，但它們的功能并不一定是均質(zhì)的。此外，MSCs的大規(guī)模體外擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致衰老，削弱其治療效果[35]。臨床試驗(yàn)幾乎普遍使用剛解凍的MSCs。冷凍保存易損害MSCs的免疫抑制特性，并縮短它們?cè)隗w內(nèi)的維持時(shí)間[36]。

5 結(jié) 語(yǔ)

軟骨組織工程學(xué)的出現(xiàn)，拓展了軟骨缺損治療的方式方法，有望克服目前軟骨損傷臨床治療的缺點(diǎn)。目前軟骨組織工程的支架材料和細(xì)胞因子研究已經(jīng)取得很大進(jìn)步，且成功開(kāi)發(fā)出各種基于聚合物支架的控釋系統(tǒng)，并用于控制生長(zhǎng)因子的遞送，以促進(jìn)軟骨再生。而基于MSCs作為種子細(xì)胞的軟骨組織工程細(xì)胞來(lái)源得到了充分保障，同時(shí)具有出色的軟骨分化能力，規(guī)避了當(dāng)前臨床治療的局限性。但是仍需注意還有諸多難點(diǎn)有待解決，例如如何促進(jìn)細(xì)胞歸巢、如何提高移植細(xì)胞的存活率及其活性等。雖然仍有許多工作要做，但這些研究將繼續(xù)推動(dòng)細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展。