張瓊文，張叁保，楊麗麗，高小童，劉笑笑，陳 婷，江明生

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

0 引言

雌性動(dòng)物的繁殖能力直接影響畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，卵泡的發(fā)育在動(dòng)物繁殖過程中占有重要地位，而卵泡發(fā)育主要受分子調(diào)控的影響。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)有COX-1和COX-2兩種亞型，其中COX-2為誘導(dǎo)型酶，即在外界條件變化時(shí)，如損傷、缺氧、卵泡增大等條件下，COX-2表達(dá)水平升高，而一般情況下表達(dá)很低。COX-2參與多種生理過程，能夠調(diào)節(jié)活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平，參與PI3K/AKT/NOTCH/Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控起到重要作用。本文就COX-2在卵泡發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)展開綜述。

1 影響卵泡發(fā)育的因素

卵泡是雌性體內(nèi)性激素合成及卵子發(fā)育成熟到排卵的基本單位，由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞組成。初級(jí)卵母細(xì)胞是通過原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)分化的卵原細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂被阻滯在雙線期形成。原始卵泡是卵泡發(fā)育的基礎(chǔ)，初級(jí)卵母細(xì)胞被單層扁平的前體顆粒細(xì)胞包圍后形成了原始卵泡，出生后兩側(cè)卵巢上便具有上百萬個(gè)原始卵泡[1]。隨著前體顆粒細(xì)胞的增殖且變成立方狀及卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，標(biāo)志著原始卵泡被募集并啟動(dòng)，發(fā)育為初級(jí)卵泡。初級(jí)卵泡分裂形成次級(jí)卵泡(secondary follicle)。

1.1 卵巢顆粒細(xì)胞的增殖分化與卵泡發(fā)育

顆粒細(xì)胞的增殖與分化能促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)、成熟。促卵泡激素(FSH)和卵泡受體( FSHR)結(jié)合，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育，刺激卵巢分泌雌激素，從而產(chǎn)生成熟卵泡。FSHR主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，顆粒細(xì)胞在卵泡優(yōu)勢(shì)發(fā)生時(shí)獲得功能性的促黃體生成素受體(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor，LHR)，LH與LHR結(jié)合使成熟卵泡發(fā)育成為優(yōu)勢(shì)卵泡，并最終排卵[2]。顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化影響著原始卵泡發(fā)育的啟動(dòng)卵泡選擇，在整個(gè)卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[3]。

1.2 顆粒細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激與卵泡閉鎖

在動(dòng)物初情期后，一些卵泡開始生長(zhǎng)并在每一個(gè)發(fā)情周期都會(huì)選擇性的排卵，并且在整個(gè)雌性生殖期內(nèi)都進(jìn)行著周而復(fù)始的循環(huán)，但是在動(dòng)物整個(gè)繁殖周期中只有一小部分卵泡能夠成功發(fā)育至排卵前卵泡并排卵，超過99%的卵泡都將在卵泡發(fā)育的過程中發(fā)生退化閉鎖[2]。在雌性哺乳動(dòng)物的生殖發(fā)育過程中，由顆粒細(xì)胞凋亡引起卵泡閉鎖，保留了最健康的卵泡(含有最佳質(zhì)量的卵母細(xì)胞)，完成最終的排卵。目前，導(dǎo)致卵泡閉鎖的主要原因是顆粒細(xì)胞的凋亡[4-5]，上調(diào)顆粒細(xì)胞中促凋亡基因Bax和P53，下調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2是影響顆粒細(xì)胞凋亡主要調(diào)節(jié)因子[6]，影響卵泡閉鎖。線粒體途徑，死亡受體途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及氧化應(yīng)激等信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。有研究表明，人類卵泡發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡僅見于生長(zhǎng)卵泡中的顆粒細(xì)胞，有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中經(jīng)常檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的發(fā)生，然而在卵泡發(fā)生的早期階段只能檢測(cè)到極少量的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。檢測(cè)人類生長(zhǎng)卵泡中的顆粒細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bax從初級(jí)卵泡階段開始就有明顯表達(dá)，而抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)主要表達(dá)在有腔卵泡及部分次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中[10]，P53在閉鎖卵泡及凋亡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[11]。

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)為一類小分子物質(zhì)，是在生物體有氧代謝過程中產(chǎn)生的，主要包括超氧化物、過氧化物及氧自由基等。細(xì)胞內(nèi)的活性氧主要來源于呼吸鏈經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程中由線粒體釋放[12]。正常情況下少量的活性氧對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、激素分泌、細(xì)胞生長(zhǎng)等是必需的；然而在一定內(nèi)源或外源因素的影響下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧會(huì)超過正常水平，由于活性氧分子通常擁有核外未配對(duì)的電子，具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性，此時(shí)活性氧會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的一些小分子，如脂類、蛋白質(zhì)及核酸等，導(dǎo)致細(xì)胞核和線粒體的DNA降解，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白變性，一些重要的酶類失活，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化等，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究表明，活性氧濃度越高，越容易加速卵母細(xì)胞衰老，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，導(dǎo)致卵母細(xì)胞調(diào)亡[12]。向體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入H2O2刺激后，卵母細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)顆?；⒓?xì)胞碎片化及核皺縮等特征，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的活性顯著上調(diào)[13]?？寡趸到y(tǒng)的失調(diào)促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡，加速了卵泡的閉鎖[14]。Monirch Mahmoodi等人將小鼠卵巢異位移植至其臀大肌內(nèi)，創(chuàng)造缺氧環(huán)境，并對(duì)野生型小鼠和卵巢異位移植鼠注射生理鹽水或N-乙酰半胱氨酸。結(jié)果表明，異位移植鼠注射N-乙酰半胱氨酸后的卵巢體積較注射生理鹽水組明顯變大，并且卵泡總數(shù)目明顯增多，同時(shí)閉鎖卵泡數(shù)目及卵泡內(nèi)戊二醛濃度(凋亡指標(biāo))明顯減少，而雌二醇濃度顯著升高，這表明N-乙酰半胱氨酸可通過降低卵巢組織的氧化應(yīng)激和凋亡水平改善卵泡發(fā)育，提高卵泡的存活能力[15]。顆粒細(xì)胞分泌的環(huán)磷酸鳥苷、環(huán)磷酸腺苷及一氧化氮等信號(hào)分子可以保護(hù)卵母細(xì)胞免ROS的損傷[16]。總而言之，顆粒細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激的增高導(dǎo)致了卵泡閉鎖退化。

2 環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因在卵泡發(fā)育中的作用

環(huán)氧合酶 (cyclooxygenase，COX) 是合成各種前列腺素 (prostaglandins，PGs )的關(guān)鍵酶。細(xì)胞膜中磷脂在磷脂酶A2 催化下釋放出花生四烯酸，后者在COX催化下形成PGH2。PGH2又分別在相應(yīng)PG異構(gòu)酶作用下合成PGE、PGF、PGD、PGI等。COX家族包括組成型酶COX-1及誘導(dǎo)型酶COX-2兩種同工酶。COX-1由管家基因編碼，其作用主要是在多數(shù)組織中穩(wěn)定表達(dá)，維持人體正常生理功能，如保護(hù)胃腸道、調(diào)節(jié)腎血流量等。COX-2為誘導(dǎo)型酶，主要分布在核膜，是排卵卵泡中前列腺素E2(PGE2 )合成的限速酶，在卵巢中主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)[17]。

前列腺素E2主要由顆粒細(xì)胞合成，是大多數(shù)哺乳類動(dòng)物排卵卵泡中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子，在誘導(dǎo)卵泡排卵、胚胎著床與發(fā)育過程中起著極其重要的角色[18]。哺乳動(dòng)物排卵前，垂體釋放大量的黃體生成素(LH)，稱為L(zhǎng)H排卵峰。LH峰能夠刺激排卵前卵泡內(nèi)的分泌功能發(fā)生劇烈的變化，當(dāng)擴(kuò)張的卵丘細(xì)胞達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)，卵泡破裂，COCs從卵泡壁脫離，將卵母細(xì)胞釋放到輸卵管中。排卵過程中，黃體生成激素激增，通過COX-2和前列腺素合酶誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞合成PGE2。PGE2 釋放到胞外后，通過結(jié)合卵丘顆粒細(xì)胞上PGE2 受體2和受體4，誘導(dǎo)MAPK磷酸化，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，并激活蛋白激酶B和MAPK通路，促進(jìn)排卵發(fā)生[19]。COX-2又稱為排卵誘導(dǎo)因子及細(xì)胞凋亡的抑制因子，可以被有絲分裂素、細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)子和生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)[20]。馬麗珠在牛卵泡顆粒細(xì)胞中對(duì)COX-2基因的研究發(fā)現(xiàn)，隨著卵泡的生長(zhǎng)，COX-2基因表達(dá)在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)顯著上升[21]。在COX-2基因敲除的雌性小鼠中，盡管卵泡可以發(fā)育，但排卵數(shù)明顯減少而且排出的卵子也幾乎不能受孕，注射PGE2又可使排卵重新恢復(fù)正常[22]。在COX-2基因缺陷的雌性小鼠會(huì)出現(xiàn)多方面的生殖功能障礙，如排卵障礙、卵子受精率下降、胚胎著床及子宮蛻膜化障礙等[23]。這些結(jié)果表明COX-2基因及PGE2在卵泡發(fā)育過程中，抑制卵泡閉鎖。

2.1 環(huán)氧合酶-2(COX-2)通過抑制細(xì)胞凋亡緩解卵泡閉鎖

顆粒細(xì)胞凋亡直接或間接地介導(dǎo)了卵泡閉鎖。研究卵巢癌細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示COX-2 抑制劑可通過調(diào)節(jié) caspase-3和caspase-9的表達(dá)來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。鄧琳等的研究發(fā)現(xiàn)將慢病毒載體Lenti-COX-2-EGFP轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和ES2后，COX-2過表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，COX-2抑制劑塞來昔布則可抑制COX-2過表達(dá)細(xì)胞的增殖及遷移能力[25]。干擾COX-2表達(dá)水平，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且是通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)[26]，說明COX-2與卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡有關(guān)。Bcl-2是較早發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)基因之一，能夠延長(zhǎng)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，其蛋白產(chǎn)物是一種重要的抗凋亡蛋白，主要分布在內(nèi)膜上，包括線粒體、核膜等，主要通過內(nèi)源通路發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，Bcl-2的過表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，從而引起腫瘤發(fā)生。在刺槐素對(duì)卵巢細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，刺槐素可以通過抑制p-NF-κB、下調(diào)COX-2表達(dá)，繼而上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的活力[27]。這些結(jié)果表明COX-2基因影響細(xì)胞凋亡，且發(fā)揮著重要作用。

2.2 環(huán)氧合酶-2(COX-2)緩解ROS升高引起的細(xì)胞凋亡

氧化應(yīng)激可以通過激活死亡受體途徑引起細(xì)胞凋亡，越來越多的研究揭示年齡引起的繁殖能力下降及停止，主要是由于氧化應(yīng)激水平增加導(dǎo)致的。對(duì)老齡鼠和青年鼠卵巢氧化應(yīng)激及繁殖力的研究發(fā)現(xiàn)，由氧化應(yīng)激引起的卵巢衰老加快，且卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率顯著上升，而繁殖能力下降[28]。在對(duì)年輕和老齡的食蟹獼猴的卵巢進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡水平的增高是其繁殖機(jī)能下降的主要原因。用21～46歲人的顆粒細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，抗氧化基因IDH1、PRDX4和NDUFB10的表達(dá)水平下降[7]；同時(shí)在老齡婦女的顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SOD和CAT基因表達(dá)下降[29]，卵泡液中的GST和GAT活性也下降[30]。對(duì)蛋雞不同產(chǎn)蛋期90 d、150 d、180 d的抗氧化基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加T-AOC、SOD、CAT的水平呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，而丙二醛MDA和氧化自由基ROS水平逐漸上升，這和產(chǎn)蛋率的下降呈現(xiàn)極強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系[31]。隨著年齡增加，在許多哺乳動(dòng)物的組織中，活性氧和自由基在線粒體中含量比率增高，對(duì)線粒體及其他細(xì)胞和組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成生物大分子氧化損傷，從而推進(jìn)衰老及繁殖技能衰退。過氧化物還原酶4(PRDX4)可以通過抗氧化應(yīng)激機(jī)制促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，抑制卵母細(xì)胞老化[32]。有研究顯示，GPX1上調(diào)進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激的同時(shí)，PGE2限速酶COX-2的表達(dá)也會(huì)隨之上調(diào)，進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激的損傷[33-34]。氧化應(yīng)激的水平增高進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖增加，目前COX-2基因抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的過程及機(jī)制研究還極其匱乏。

2.3 環(huán)氧合酶-2(COX-2)在PI3K/AKT/NOTCH/Wnt通路上的研究

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞增殖調(diào)控的重要通路之一，主要是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖來抗凋亡，PI3K被激活后動(dòng)力激活A(yù)KT(pAKT)，AKT激活后磷酸化大量下游底物，可以通過調(diào)節(jié)mTOR/Raptor復(fù)合物1(mTORC1)的活性來調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖[35]，AKT通過抑制Caspase-9和Bcl-2家族成員失活等多種下游信號(hào)分子的磷酸化來阻斷細(xì)胞凋亡。因此激活A(yù)KT不僅可以防止顆粒細(xì)胞的凋亡，而且還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[36]。pAKT 也可以通過多重磷酸化作用滅活促凋亡蛋白或抑制叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子(FOXO家族，如FOXO3a)激活進(jìn)而下調(diào)促凋亡蛋白(Bax)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活[37]，在卵泡發(fā)育成熟過程中調(diào)控顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡發(fā)揮了重要的作用[38]。NF-kB是PI3K/AKT信號(hào)通路的下游主要效應(yīng)子，很多研究表明激活PI3K/AKT/ NF-kB可以增強(qiáng)細(xì)胞的存活及抗凋亡能力[39-40]。Notch信號(hào)通路在在癌癥中可以通過Bcl-2介導(dǎo)細(xì)胞增殖和抗凋亡能力[41]，也可以和PI3K/AKT、TGFβ、NF-kB、Wnt、雌激素受體信號(hào)通路形成交叉對(duì)話，同時(shí)這些分子及信號(hào)通路對(duì)Notch信號(hào)通路具有重要調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而可以對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。Wnt/β-Catenin信號(hào)通路通常分為經(jīng)典的β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)依賴性途徑和非依賴性途徑，沒有Wnt配體的情況下，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路處于失活狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞的增殖存活以及干細(xì)胞的自我更新和分化方面有重要的作用[42]。以上結(jié)果證實(shí)，以上分子、信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡、增殖過程，并起著重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，姜黃素可能通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7402中COX-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖[43]。在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC-5研究中，結(jié)果揭示抑制COX-2基因表達(dá)可通過降低MRC-5細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞膠原合成和轉(zhuǎn)化，并下調(diào)Notch信號(hào)通路，從而對(duì)肺纖維化起保護(hù)作用[44]。在子宮肌瘤細(xì)胞的研究中，環(huán)氧合酶-2(COX-2)選擇性抑制劑塞來昔布(celecoxib) 通過Wnt信號(hào)通路抑制肌瘤細(xì)胞的增殖[45]。在肉骨瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，將高表達(dá)COX-2基因的MG63細(xì)胞用PI3K抑制劑LY294002、Notch抑制劑 LY411575以及Wnt抑制劑IWP-2分別單獨(dú)抑制相關(guān)通路后，均可產(chǎn)生抑制COX-2的效果。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了COX-2及PI3K蛋白活性的抑制可以導(dǎo)致p-PI3K、NOTCH及Wnt蛋白含量下降。這些結(jié)果提示COX-2、PI3K、Notch以及Wnt分子之間/信號(hào)通路之間存在相互對(duì)話或關(guān)系。

3 結(jié)語

在成年雌性動(dòng)物體內(nèi)，隨著卵泡的生長(zhǎng)顆粒細(xì)胞中COX-2基因表達(dá)上升。顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要原因，因此推測(cè)COX-2基因在卵泡顆粒細(xì)胞中可能通過抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，維持卵泡的生長(zhǎng)及優(yōu)勢(shì)化，進(jìn)而作為排卵誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)排卵，COX-2通過PI3K/AKT、Notch、Wnt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖的維持與抗凋亡發(fā)揮作用均有相關(guān)報(bào)道，但這些分子之間可能存在某種順序調(diào)控及交叉對(duì)話，其相關(guān)報(bào)道較少。今后對(duì)COX-2的研究重點(diǎn)可放在其通過PI3K/AKT/Notch/Wnt信號(hào)通路維持顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡，進(jìn)而研究其誘導(dǎo)排卵的串聯(lián)機(jī)制。