楊 旭

(恩施州動物疫病預(yù)防控制中心，湖北 恩施 445000)

0 引言

非洲豬瘟(African Swine fever，ASF)是一種豬病毒性疾病，對家豬致死率高，而在豬瘟的自然宿主中無癥狀。在缺乏疫苗有效保護(hù)的情況下，ASF可造成重大經(jīng)濟(jì)損失，目前對ASF感染的控制主要為疫區(qū)的檢疫及感染動物無害化處理[1]。ASF是由ASF病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染引起，ASFV是雙鏈DNA病毒，具有較復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，屬于非洲豬瘟病毒科，可通過節(jié)肢動物進(jìn)行傳播。該非洲豬瘟病毒最先于肯尼亞在20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)，之后迅速蔓延世界各個地區(qū)，2019年，我國首次報道了非洲豬瘟感染[2]。

1 病原學(xué)

ASFV是一種具有包膜結(jié)構(gòu)、直徑為200 nm的病毒。 病毒具有二十面形態(tài)，其基因組由約180 Kbp堿基的雙鏈DNA組成，編碼約160個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)。研究顯示病毒主要在胞質(zhì)中復(fù)制，病毒感染早期也可在胞核復(fù)制。病毒基因的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的調(diào)控，目前已鑒定出四類病毒mRNAs，包括超早期、早期、中期和晚期轉(zhuǎn)錄基因。在DNA復(fù)制開始前超早期和早期病毒mRNA就已經(jīng)表達(dá)，中間和晚期病毒mRNA的存在表明了ASFV基因表達(dá)調(diào)控的級聯(lián)模型。病毒進(jìn)入宿主的細(xì)胞質(zhì)后其包膜中的相關(guān)因子即開始表達(dá)基因組復(fù)制所需要的各種酶[3]。

2 病毒吸附與侵入

ASFV可吸附到宿主細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞。研究表明，這一過程是低pH和溫度依賴性的，這與Vero細(xì)胞和豬巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用是一致的。然而，病毒的受體尚不清楚。ASFV感染細(xì)胞具有一定的限制性，說明病毒的感染過程需要特異性受體。CD163是一種巨噬細(xì)胞成熟的標(biāo)志，是ASFV感染潛在的受體。最近的研究表明，病毒分離株Georgia 2007/1感染不需要CD163[4]。應(yīng)用CRISPR/casa9技術(shù)的CD163敲除轉(zhuǎn)基因豬感染非洲豬瘟病毒后，并無明顯的臨床癥狀、病理學(xué)變化、病毒血癥和死亡率。以上研究提示CD163影響病毒的復(fù)制和感染過程。此外，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的部分標(biāo)志物可能參與病毒復(fù)制和感染過程。除了病毒通過受體吸附宿主細(xì)胞外，也有跡象表明ASFV使用其他機(jī)制，如吞噬作用和胞飲作用。這些機(jī)制是利用單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)對該病毒進(jìn)行分離時發(fā)現(xiàn)的。同時，如P12、P30和P54等的一些病毒結(jié)構(gòu)蛋白也參與了病毒復(fù)制及感染過程[5]。

3 病毒內(nèi)吞途徑

ASFV通過內(nèi)吞體(endosome)途徑進(jìn)入復(fù)制過程。內(nèi)吞體的成分主要有蛋白質(zhì)和脂類，這些蛋白質(zhì)和脂類隨病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后被吸收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中。Rab-GTPase蛋白家族是內(nèi)吞體的主要調(diào)控因子。研究表明，在被吸附的很短時間內(nèi)，可在早期內(nèi)吞體中發(fā)現(xiàn)感染機(jī)體的病毒粒子。只有在早期才能發(fā)現(xiàn)已經(jīng)包裝成熟的病毒粒子，在感染中后期的成熟內(nèi)體中沒有觀察到pH值下降。CD63是病毒內(nèi)吞體成熟的表面標(biāo)志之一，此外病毒成熟的標(biāo)志還包括腔內(nèi)小泡和表面標(biāo)志Rab7的表達(dá)。當(dāng)病毒顆粒成熟透過內(nèi)膜后，可與內(nèi)吞膜相互作用融合在一起。病毒裸核被釋放到細(xì)胞質(zhì)中并開始復(fù)制。研究表明，這一過程高度依賴于來自細(xì)胞內(nèi)膜的膽固醇水平。膽固醇水平的阻斷將導(dǎo)致病毒滯留在細(xì)胞內(nèi)，并抑制病毒感染的過程。其他內(nèi)體成熟抑制劑，如Wordtmannine，可能會阻止早期內(nèi)吞體合成，而諾可達(dá)唑可能會干擾內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)，防止ASFV感染[6]。

4 病毒基因表達(dá)和DNA復(fù)制

脫殼的病毒顆粒到達(dá)微管組織中心(MTOC)附近核周區(qū)的復(fù)制位點(diǎn)。在DNA復(fù)制開始前，超早期和早期DNA鏈都可以用作編碼基因鏈。這可能與病毒核心的幾種酶在病毒轉(zhuǎn)錄中的作用有關(guān)。DNA復(fù)制后，中晚期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯合成病毒蛋白，其余20%DNA負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和蛋白的修飾，這種轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制使該病毒與宿主轉(zhuǎn)錄機(jī)制不同，在時間和空間上精確控制其基因表達(dá)。蔗糖梯度離心法對復(fù)制病毒DNA的沉淀分析表明，在病毒DNA復(fù)制的早期階段，細(xì)胞核中合成了小的DNA片段，而后期細(xì)胞質(zhì)中合成了大分子[7]。

5 病毒工廠的產(chǎn)生

微管是必要的運(yùn)輸病毒復(fù)制到核周區(qū)的結(jié)構(gòu)。病毒工廠的形成需要微管的完整性，病毒顆粒的運(yùn)輸與穩(wěn)定的微管有關(guān)。諾可達(dá)唑干擾微管絲的聚合，從而阻止病毒工廠的形成。結(jié)構(gòu)蛋白P54在病毒感染過程中與動力蛋白互作，可能參與了微管轉(zhuǎn)運(yùn)病毒的過程。病毒顆粒組裝位于靠近核心的胞質(zhì)中，病毒核酸和蛋白積聚，新合成的病毒顆粒被組裝起來。病毒工廠周圍的纖維蛋白結(jié)構(gòu)可以阻止病毒成分進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，使結(jié)構(gòu)蛋白集中在組裝部位。病毒復(fù)制位點(diǎn)的形成取決于許多因素。例如Rho-GTPase抑制劑可以通過積累前體和不成熟的病毒顆粒產(chǎn)生異常的病毒工廠。MTOC包含病毒DNA、大多數(shù)病毒蛋白、未成熟和成熟的病毒顆粒以及豐富的膜結(jié)構(gòu)。首先病毒的衣殼和核殼結(jié)構(gòu)域進(jìn)行組裝形成二十面體的前體。之后病毒核酸膜形成，這是病毒顆粒形態(tài)成熟的最后一步，由此產(chǎn)生成熟的病毒顆粒。驅(qū)動蛋白將成熟的病毒離子轉(zhuǎn)出病毒工廠，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，通過細(xì)胞出芽外排至細(xì)胞外。

6 病毒釋放

成熟的病毒顆粒依靠經(jīng)典驅(qū)動蛋白和衣殼蛋白pE170R，經(jīng)微管通道從病毒工廠轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，最后通過出芽方式排出細(xì)胞外并獲得一層外膜。研究顯示，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的病毒都具有復(fù)制和感染特性，但其抗原性和免疫原性均有所不同，這在宿主對非洲豬瘟的免疫應(yīng)答中起十分重要的作用[8]。

7 抗病毒復(fù)制藥物

在疫苗研制及普及使用之前，抗病毒藥物使用仍對該病的防控有一定的意義。抗病毒藥物有助于病毒爆發(fā)后的早期控制。目前報道的ASFV的抗病毒藥物包括白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇、微藻、降膽固醇藥物或膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、抗腫瘤的月桂基沒食子酸鹽、抗驚厥藥丙戊酸鈉、動力素抑制劑、氟喹諾酮類藥物及絲氨酸蛋白酶抑制劑等[9]。這些藥物可用于快速反應(yīng)，減少易感動物，以便在疫情周圍建立“安全區(qū)域”，從而控制感染的傳播。此外，抗病毒藥物與疫苗接種方案的結(jié)合可用于誘導(dǎo)有效預(yù)防疾病所需的免疫應(yīng)答。