張明昌，陳 威，諶小軍，李 敏，葛正行

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，貴陽 550000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院，貴陽 550000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種常見的以氣道重塑、慢性炎癥、肺泡破壞和纖維化為特征的致死性間質(zhì)性肺病[1]，主要表現(xiàn)為進行性的呼吸困難和肺功能惡化，最終因呼吸衰竭而死[2]，其發(fā)病率高、生存率低、預(yù)后不良，已成為危害人類健康的主要疾病，尋找有效可靠的治療藥物是目前亟待解決的問題之一.目前僅有吡非尼酮和尼達尼布被批準用于治療IPF[3-4]，但研究顯示吡非尼酮對延長IPF患者生存時間的作用并不理想[5].此外，巨大的經(jīng)濟負擔(dān)已成為IPF患者治療的阻力[6].

近年研究顯示中醫(yī)藥治療IPF具有良好的療效及安全性[7].槲皮素是自然界廣泛存在的黃酮類化合物中的一種，可從多種中草藥中進行提取，具備廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化應(yīng)激以及抗感染等，此外大量實驗研究表明其還具有顯著的抗肺纖維化的重要作用.槲皮素可恢復(fù)衰老的IPF成纖維細胞對促凋亡刺激的敏感性，有效降低博來霉素致小鼠肺纖維化程度，減緩肺纖維化進程，減輕肺部病理損傷，保護肺臟[8-9].因此，槲皮素具有一定防治IPF的藥理基礎(chǔ)，但其產(chǎn)生作用的有效成分及作用于IPF的通路、靶點尚不清楚.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對“藥物、疾病、基因、靶點”進行網(wǎng)絡(luò)分析，挖掘藥物治療疾病多靶點的內(nèi)在聯(lián)系的新學(xué)科，主要以系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)及計算機分析技術(shù)為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，可整體系統(tǒng)地分析藥物成分與疾病之間的相互作用關(guān)系，從分子生物學(xué)層面多方位揭示中藥有效成分治療疾病的潛在作用機制，對藥物作用機制研究以及中藥新藥創(chuàng)新研發(fā)具有重要意義[10].因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對槲皮素治療IPF的作用機制進行研究，并通過分子對接技術(shù)驗證化合物-潛在靶點的對接活性，為后期的臨床研究以及新藥研發(fā)提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 獲取槲皮素結(jié)構(gòu)及靶點信息

從PubChem數(shù)據(jù)庫[11](pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載槲皮素的3D-sdf格式及Canonical SMILES號，將其分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[12]、Targetnet數(shù)據(jù)庫[13]進行靶點預(yù)測，根據(jù)可能性(probability)大于0進行篩選，合并去重后得到槲皮素的相關(guān)靶點蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點蛋白轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的人源性基因名，方便進一步的數(shù)據(jù)分析.

1.2 IPF相關(guān)疾病基因獲取及槲皮素治療IPF潛在靶點預(yù)測

OMIM(https://omim.org)、DISGENET(http://www.disgenet.org/home/)、比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫[14](CTD)等數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點，輸入關(guān)鍵詞為“idiopathic pulmonary fibrosis”，合并去重后獲得與TPF相關(guān)的靶點基因.將藥物靶點及疾病靶點導(dǎo)入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)獲取兩者的交集基因，視為槲皮素治療IPF的潛在靶點基因.

1.3 交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心節(jié)點網(wǎng)絡(luò)篩選

將槲皮素治療IPF的潛在靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫[15]，限定物種為人，去除游離基因后得到交集基因的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，保存其TSV格式文件，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件[16]進行可視化及網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以degree值反映基因作用大小，并根據(jù)degree值大小獲取核心節(jié)點網(wǎng)絡(luò).

1.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將交集基因?qū)牍δ茏⑨屔镄畔W(xué)分析平臺DAVID數(shù)據(jù)庫[17]進行生物過程、分子功能、細胞組分的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析.將所得結(jié)果根據(jù)P值降序排列(P<0.05)，并取基因富集數(shù)最多的前20條信息進行可視化.

1.5 構(gòu)建“化合物-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將槲皮素、交集基因及相關(guān)通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò).該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物、靶點、通路及疾病，連線代表節(jié)點之間的相互作用.經(jīng)拓撲網(wǎng)絡(luò)分析后采用degree值評判節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，degree數(shù)越大者，說明其網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)性越大、重要性越強.

1.6 分子對接

將化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度數(shù)最高的前3個靶點作為受體，將其與槲皮素進行分子對接，以驗證槲皮素與靶點蛋白的結(jié)合活性.從PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中獲得核心靶點受體的人源性蛋白及其配體復(fù)合物，將從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載的槲皮素的3D-SDF結(jié)構(gòu)則作為配體，利用PyMOL軟件去除靶蛋白的水分子、配體，將SDF三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為PDB格式，用AutoDock Tools對受體和配體進行預(yù)處理后保存為PDBQT格式待用.最后利用AutoDock Vina軟件[18]對配體及受體進行分子對接.

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素潛在靶點的獲取

通過PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得槲皮素的結(jié)構(gòu)信息，如表1、圖1所示.從Targetnet、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中篩選出IPF靶點并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫校對后，合并去重后得到185個潛在靶點基因.按照相關(guān)性(Probability>0)進行排序，選取前15個基因名稱和靶點展示，如表2所示.

表1 槲皮素的結(jié)構(gòu)信息

表2 槲皮素排名前15的潛在靶點

2.2 IPF疾病基因及槲皮素治療IPF潛在靶點

從OMIM、DISGENET、CTD數(shù)據(jù)庫中獲取IPF相關(guān)基因靶點共有3 995個.將IPF疾病基因與槲皮素靶點基因通過Venny映射篩選出共同靶點105個，將其視為槲皮素治療IPF的潛在靶點基因，如圖2所示.

圖1 槲皮素的2D分子結(jié)構(gòu)圖圖2 槲皮素與IPF靶點韋恩圖

2.3 槲皮素治療IPF潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將String數(shù)據(jù)庫得到的蛋白相互作用PPI信息的“TSV”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及102個節(jié)點，780條邊，如圖3所示.其中節(jié)點表示蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，該網(wǎng)絡(luò)中超過2倍中位數(shù)degree值(18)的靶點蛋白有26個，如表3所示，視其為核心靶點蛋白，說明上述靶點很可能是槲皮素治療IPF的關(guān)鍵.

圖3 槲皮素治療IPF潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 槲皮素治療IPF的核心靶點

2.4 GO和KEGG分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫，對105個交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析(P<0.05)，通過微生信在線作圖網(wǎng)站將分析結(jié)果進行可視化，結(jié)果顯示：GO功能富集分析得到GO條目327條(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目216條，包括：蛋白質(zhì)自身磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、氧化還原過程等；細胞組成(CC)條目40條，包括：細胞質(zhì)、核漿、線粒體、細胞外區(qū)域等；分子功能(MF)條目71條，包括：蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白激酶活性相同蛋白結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等，選取富集基因數(shù)最多的前10條條目進行展示，如圖4所示.KEGG通路富集分析得到74條信號通路(P<0.05)，涉及癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路等，如圖5所示.

圖4 GO功能富集分析結(jié)果 圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)

槲皮素治療IPF的靶點-通路網(wǎng)絡(luò)如圖6所示.右側(cè)藍色倒三角代表槲皮素與IPF的交集靶點，右側(cè)黃色三角代表基因富集數(shù)最多的前20條通路，進一步利用Network Aalyzer插件對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，結(jié)果顯示：AKT1、PIK3CG、RELA等靶點和癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等信號通路的degree值較高，分別為19、18、13、19、17、13，說明上述靶點和通路在該生物網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用.因此，可認為槲皮素可能通過作用于AKT1、PIK3CG、RELA等靶點，介導(dǎo)癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等對IPF產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng).

圖6 槲皮素治療IPF的化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接結(jié)果

為進一步研究槲皮素與關(guān)鍵靶點間的相互作用關(guān)系，利用AutoDock Vina軟件進行分子對接，對接結(jié)果如表4、圖7所示.一般認為對接分數(shù)小于-7.0表明活性成分與靶點具有強烈的結(jié)合活性，小于-5.0表明兩者有較好的結(jié)合活性，小于-4.25表明有一定的結(jié)合活性[19].

表4 槲皮素與關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果

圖7 槲皮素degree值最高的前3個靶點的分子對接圖

3 討論

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種原因不明的以慢性、進行性肺間質(zhì)纖維化為主要特征的肺系疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，可能與炎癥反應(yīng)、肺組織的不均勻受累、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的激活，上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等有關(guān)[20].槲皮素是多種中藥中可被人體吸收代謝的有效成分之一，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[21],近年來諸多學(xué)者對槲皮素抗肺纖維化的生物學(xué)效應(yīng)進行較為深入的研究，藥理研究表明槲皮素能夠通過調(diào)控Smad7信號來實現(xiàn)緩解TGF-β誘導(dǎo)的小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞NIH3T3纖維化[22]，此外，槲皮素能有效抑制實驗大鼠的肺纖維化進展，同時有效促進肺組織的自我修復(fù)[23]，但其作用靶點及通路尚不完全明確，因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建槲皮素-IPF-共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)等，系統(tǒng)分析槲皮素治療IPF的作用機制.

通過OMIM等相關(guān)數(shù)據(jù)庫，篩選出槲皮素及IPF相關(guān)基因，取交集后共得出槲皮素與IPF共同靶點105個，占槲皮素預(yù)測相關(guān)基因的56.76%，表明槲皮素可有效作用于IPF，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，進一步通過化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素通過AKT1、PIK3CG、RELA等靶基因介導(dǎo)癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等發(fā)揮治療IPF的作用.

AKT1是絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)家族中的一個亞型，其通過促使下游底物的磷酸化來參與細胞生長、代謝、增值、凋亡等重要細胞生物學(xué)過程[24].AKT1可通過mTOR蛋白磷酸化而激活，并促進相關(guān)蛋白表達，進而促進基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，在纖維化過程中具有重要作用[25].研究表明，通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，可提高肺組織細胞自噬活性，緩解肺纖維化進程[26].研究證實，槲皮素可以通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制人胚肺成纖維細胞地增值[27].此外，在肺纖維化早期通過抑制p-AKT表達，可以起到抗肺纖維化的作用[28].Ras是PTKs介導(dǎo)的信號通路中的關(guān)鍵蛋白.上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺肌成纖維細胞形成的重要過程.大量研究表明，Ras/ ERK1/2信號通路在肺纖維化中具有重要作用.成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)可通過刺激Ras/ERK1/2的激活，負調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的EMT來抑制肺纖維化[29].目前認為IPF是引發(fā)肺癌的高危因素，會增加患肺癌的風(fēng)險，因此涉及多個癌癥信號通路，可能與異常成纖維細胞增殖、表觀遺傳和遺傳變化、細胞間通訊減少等有關(guān).RELA是核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB)家族中的成員之一，是一種廣泛存在于真核生物內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB通路在細胞增殖、存活、早期病毒應(yīng)答及細胞因子分泌、促炎等多方面具有重要作用[30].研究證實槲皮素能夠抑制NF-kB通路，從而減少大鼠炎癥細胞及TNF-α等的釋放，達到緩解肺纖維化進展的目的[31].PIK3CG是IB型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的亞型，主要在免疫細胞與內(nèi)皮細胞中表達，參與免疫應(yīng)答[32].PI3K/AKT信號通路可以調(diào)節(jié)下游與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的NF-kB信號的激活[33].動物實驗表明，花椒有效成分可下調(diào)PIK3CG和p-NF-kB的表達，從而減輕小鼠足爪組織中的炎癥反應(yīng)[34].IPF的具體機制目前尚不明確，目前認為自身免疫功能異常與炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致IPF發(fā)病的重要因素，而PIK3CG有參與機體免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用.因此，我們預(yù)測槲皮素可調(diào)控RELA、PIK3CG基因介導(dǎo)其下游通路發(fā)揮生物效應(yīng)，但仍需進一步實驗驗證.分子對接結(jié)果表明，槲皮素與AKT1、PIK3CG、RELA 等靶點的結(jié)合能均小于-5kJ/mol，均可生成氫鍵，說明其與潛在靶點的結(jié)合性較高，因此推測，槲皮素未來可能成為治療IPF的有效化合物之一，可為新藥的研發(fā)提供新思路.

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)分析了槲皮素在治療IPF中的分子生物學(xué)機制，得出了槲皮素治療IPF的潛在靶點，涉及的分子功能、生物過程及作用通路，為中醫(yī)藥治療IPF提供了新的研究思路.雖然本研究所提及的一些通路已被證實有效，但由研究結(jié)果可知，槲皮素可通過多靶點介導(dǎo)多通路發(fā)揮治療作用，因此仍值得進一步研究.運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)的其他未被驗證的靶點及通路有待進一步研究證實.目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究所涉及的數(shù)據(jù)庫存在數(shù)據(jù)不全、更新速度慢等不足，對研究結(jié)果存在一定影響，因此，后期將結(jié)合具體的實驗研究驗證上述預(yù)測結(jié)果，為槲皮素治療IPF提供更科學(xué)的理論和實驗依據(jù).