鄢鵬飛，田 瑞，王雪兒，朱于鵬，孫國根，程 超，莫開菊，汪興平*

(1.湖北民族大學 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；2.風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室(湖北民族大學)，湖北 恩施 445000；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000；4.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

硒是人體所必需的一種微量元素，但其具有營養(yǎng)和毒性雙重作用[1]，由于其毒性和營養(yǎng)性的作用劑量都很微量，因此對硒的攝入需要嚴格把控.人體攝入合適劑量的硒有許多益處，包括抗氧化、抗疲勞、對重金屬中毒的解毒作用、調(diào)節(jié)人體免疫力以及防治心血管疾病和癌癥等功效[2-5]；但是過量的硒攝入會對生命體造成一定的毒副作用，嚴重的甚至造成死亡.硒的毒性大小與其存在形式存在很大關系，一般來說有機硒的毒性要小于無機硒，消費者對于硒補充劑的選擇也更偏向于有機硒，但現(xiàn)如今市場上的主流硒補充劑還是無機硒，因而尋找一種合適的有機硒補充劑有很好的市場前景.油菜相較于其他品種植物具有更好的富硒能力[6]，而且可很好地將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒并富集.有研究表明，油菜中硒的主要賦存形式為蛋白質(zhì)硒，王玉榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)油菜籽粒中硒的主要形態(tài)是以硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸有機小分子硒化合物為主.我國的富硒油菜栽培技術也十分成熟，其具有成為優(yōu)良硒補充劑的潛力，但對于富硒油菜的毒理和安全方面鮮有研究.進行富硒油菜粉在大鼠體內(nèi)的急性毒性實驗和30 d喂養(yǎng)實驗，探究富硒油菜粉的急性毒性和安全性，可為其生產(chǎn)和應用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年的SPF級wistar大鼠，體質(zhì)量150～200 g，數(shù)量60只，雌雄各半，使用大鼠專用生長維持飼料飼喂，由遼寧生長生物技術股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(遼)2020-0001，清潔級證書編號為210726200100476017.

1.2 主要材料

富硒油菜粉，硒含量為4 000 mg/kg，過200目篩，由恩施硒圣植物科技有限公司提供；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(IFCC法)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(天門冬氨酸底物法)，尿素測定試劑盒(酶偶聯(lián)監(jiān)測法)，肌酐測定試劑盒(肌氨酸氧化酶法)，均購自濰坊三維生物工程集團有限公司.

1.3 主要儀器

PTX-3102型電子天平，華志(福建)電子科技有限公司；TMS-1024i型全自動生化分析儀，日本東京醫(yī)療.

1.4 方法

1.4.1 急性毒性實驗設計 實驗采用霍恩法，組距選取為3.160.將40只成年的SPF級wistar大鼠(雌雄各半，體質(zhì)量為150～200 g)平均分為8組，編號為♀-1到♀-4，和♂-1到♂-4；適應性喂養(yǎng)7 d后正式實驗.

將富硒油菜粉以蒸餾水配成不同濃度的懸濁液，按大鼠體質(zhì)量進行灌胃給藥，灌胃前對所有大鼠禁食14 h(灌胃前天晚上對其斷食，14 h后的第2 d進行灌胃，灌胃結(jié)束2 h后再投放飼料)，不禁水.各組灌胃劑量見表1.灌胃結(jié)束后對大鼠進行觀察，記錄異常行為、進食量、體質(zhì)量變化情況以及毒性表現(xiàn)和死亡情況，時長為14 d，對死亡大鼠進行剖檢.觀察期結(jié)束后處死所有大鼠并進行解剖，觀察臟器狀況并稱濕重，用于臟器指數(shù)計算.

表1 實驗分組及灌胃劑量

1.4.2 30 d喂養(yǎng)實驗 富硒油菜粉提供企業(yè)以及目前研究所推薦的抗癌人體攝入量為5.7 μg/kg·BW(按70 kg成人體質(zhì)量計算)[8]，將人的臨床劑量轉(zhuǎn)化為試驗大鼠的劑量，為6.3·A=35.9 μg/kg·BW，為便于計算選取劑量為以硒計36 μg/kg·BW，考慮安全性采取該劑量的10倍，即實驗組富硒油菜粉劑量為0.09 g/kg·BW(以硒計0.36 mg/kg·BW)，30 d內(nèi)每日采取灌胃給藥.在30 d的觀察期中記錄每日進食量，每3 d記錄1次體質(zhì)量，在15 d斷尾取血，30 d屠宰實驗心臟取血，血液離心后取血清用于血生化指標分析.觀察期結(jié)束后剖檢大鼠，并記錄臟器濕重，用于計臟器比計算.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗分析

2.1.1 臨床實驗觀察 在灌胃結(jié)束30 min后，雌雄兩種性別的第1組(0.316 g/kg·BW)和第2組(1.000 g/kg·BW)組大鼠的各種日常行為均無異常，精神狀況良好；兩種性別的第2組大鼠在第1天的采食量有少許降低，第2天恢復正常，且之后每日采食量趨于穩(wěn)定.兩種性別的第3組(3.160 g/kg·BW)大鼠在灌胃結(jié)束后很快就出現(xiàn)了精神萎靡的狀況，但并不嚴重，其對于外界的刺激反應依舊明顯，該劑量組大鼠精神狀況及日常行為在第2天恢復正常，采食量較1、2組在第1天有大幅度的降低，第3天恢復正常.雌雄1、2、3組大鼠在觀察期間均無死亡.

最高劑量組第4組(10.000 g/kg·BW)在灌胃達到要求劑量后，雌雄大鼠均在5 min后出現(xiàn)嚴重的精神萎靡，活動量減少，對外界刺激變得不敏感，之后還出現(xiàn)毛發(fā)豎立，嗜睡乏力，扎堆縮成一團，嚴重者甚至出現(xiàn)閉眼和呼吸窘迫，食欲廢止.這些不良狀況隨時間慢慢恢復，雄性組在6 d后恢復正常，而雌性組在第1天死亡2只，觀察到死亡大鼠肛門部位有黃色分泌物，鼻子處有少量血跡，剩余3只在7 d后精神和行為恢復正常，采食量在第10天恢復正常，但有一只在第15天觀察到嚴重的腹水狀況.

2.1.2 LD50的計算 依據(jù)國標GB.15193.3-2014中的霍恩表，由于死亡數(shù)量并未達到表中最低數(shù)目，可得出該富硒油菜粉在大鼠體內(nèi)的LD50要大于表中最高劑量2.82 g/kg·BW，以硒計11.28 mg/kg·BW.但借鑒熊浩明[9]、周一平等[10]的方法，采用SPSS分析軟件計算LD50，計算出其LD50為11.75 g/kg·BW，以硒計為47 mg/kg·BW.

2.1.3 大鼠急性染毒后進食量和體質(zhì)量變化 在急性染毒完成后的14 d觀察期內(nèi)，各組大鼠的日均采食量和平均體質(zhì)量如圖1～2所示.兩種性別大鼠的1、2組采食量變化不明顯，除灌胃后的第1天采食量有極少的降低外，其余每天采食量趨于穩(wěn)定；雌雄第3組的采食量在前3 d較低，但隨時間逐步恢復；而最高劑量的第4組需要更長的恢復時間，雌性組比雄性組恢復更慢，雄性組在第6天恢復，雌性組在第10天.

(a) 雌性大鼠(b) 雄性大鼠

體質(zhì)量變化與每日采食量有很大關系，兩種性別的第1、2、3組的大鼠體質(zhì)量每3 d都會有一定增長；雄性第4組在第1個3 d體質(zhì)量有所降低，在之后的觀察期中該組大鼠的體質(zhì)量逐步恢復并緩慢慢增長；而雌性第4組在前9 d中體質(zhì)量都呈降低趨勢，之后才開始恢復.

(a) 雌性大鼠(b) 雄性大鼠

2.1.4 大鼠急性染毒后病理解剖 對急性染毒死亡的大鼠解剖發(fā)現(xiàn)：肝臟呈不健康的棕褐色，表面出現(xiàn)出血點，部分部位有黃白色壞死灶；肺部存在淤血且水腫，顏色呈不正常的暗紅色；心臟顏色暗紅，冠狀動脈處有淤血血塊；脾臟和腎臟色澤出現(xiàn)異常，較正常色澤偏黑.存活大鼠大體解剖發(fā)現(xiàn)：除雌性第4組外，其余大鼠的各類臟器均未觀察到肉眼可見的病變；雌性第4組的3只存活大鼠中1只未觀察到病變，1只出現(xiàn)嚴重的腹水，最后1只未出現(xiàn)腹水，但后2只大鼠的肝臟均出現(xiàn)了明顯病變，肝臟表面不再光滑，出現(xiàn)明顯的顆粒物質(zhì)，其余臟器未觀察到病變.

2.1.5 富硒油菜粉對大鼠臟器指數(shù)的影響 各組大鼠的臟器指數(shù)如表2所示.經(jīng)過富硒油菜粉急性染毒后，隨劑量增加雌雄兩種性別的各組大鼠的臟器指數(shù)大致會呈現(xiàn)增加的趨勢，但前3組組間各類臟器指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，最高劑量組第4組各類臟器指數(shù)出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，且出現(xiàn)較大增長.

表2 富硒油菜粉對大鼠臟器指數(shù)的影響

2.2 30 d毒性實驗分析

2.2.1 日均采食量和體質(zhì)量變化 在30 d的喂養(yǎng)過程中，雌性對照組有1只在第7天由于灌胃操作失誤造成肺部破損死亡，雄性實驗組有1只于第29天由于之前斷尾取血傷口處理不當，而使尾巴部傷口感染造成死亡，對其大體解剖未觀察到肉眼可見病變.各組大鼠進食量和體質(zhì)量如圖3～4所示，兩種性別的實驗組和對照組采食量都大致穩(wěn)定，在第16天由于斷尾取血造成采食量有一定波動；兩種性別大鼠實驗組和對照組之間體質(zhì)量變化差異并不明顯.

圖3 富硒油菜粉30 d喂養(yǎng)實驗對大鼠日均采食量的影響圖4 富硒油菜粉30 d喂養(yǎng)實驗對大鼠體質(zhì)量的影響

2.2.2 臟器指數(shù)與部分重要血生化指標 30 d喂養(yǎng)后解剖各組大鼠，各組臟器指數(shù)見表3.雄性實驗組除腎臟外，其余各臟器指數(shù)均有少量升高；雌性實驗組各臟器指數(shù)都少量升高.但實驗組和對照組之間的所有臟器指數(shù)并無顯著差異(P>0.05).

表3 30 d喂養(yǎng)對大鼠臟器指數(shù)的影響

雌雄組兩次部分血生化指標測定結(jié)果如表4所示.兩次的血生化指標結(jié)果都是雄性實驗組與對照組的ALT之間存在顯著性差異(P<0.05)，其他指標均不存在顯著性差異(P>0.05).

表4 部分血液生化指標測定結(jié)果

3 討論

3.1 富硒油菜粉在大鼠體內(nèi)的急性毒性

大鼠在急性染毒后，低劑量的兩組(0.316 g/kg·BW和1.000 g/kg·BW)日常行為和精神狀況未觀察到異常，第3組(3.160 g/kg·BW)在染毒后很快就表現(xiàn)出了精神萎靡、食欲廢止等中毒行為，而最高劑量的第4組(10.000 g/kg·BW)在染毒完全后很快就出現(xiàn)相似的癥狀，且癥狀較第3組更為嚴重，恢復時間更長，甚至出現(xiàn)死亡，可見富硒油菜粉的急性毒性呈現(xiàn)出明顯量效關系和性別差異，在雌性大鼠體內(nèi)毒性更大.

體質(zhì)量的變化可以很直觀地反映出實驗動物的健康情況以及中毒后的表現(xiàn)[11].硒作為生物體所必需的一種微量元素，在合理的攝入量下具有促進生長發(fā)育的功效，對動物的體質(zhì)量增長有一定促進作用.在本次實驗中，最大劑量組的第4組在短期內(nèi)大量給藥，其他組也分別給予一定油菜粉，因而可能在短期內(nèi)使大鼠食欲有所減退，對大鼠的消化系統(tǒng)也可能產(chǎn)生一定影響，從而造成前期日均采食量的降低以及體質(zhì)量的一定程度丟失.而雌性第4組，最后幾天觀察期間該組大鼠平均體質(zhì)量異常升高，這可能是因為有大鼠出現(xiàn)腹水狀況，造成了體質(zhì)量的上升.

對死亡大鼠進行剖檢觀察到的狀況可推斷出富硒油菜粉的急性毒性的主要靶器官為肝臟、腎臟、肺臟、心臟和脾臟.臟器指數(shù)在毒性實驗評價中有著重要的地位，而結(jié)果表明，各類臟器指數(shù)與富硒油菜粉呈現(xiàn)明顯的量效關系，隨劑量的增加而上升，也反映出上述的臟器為其急性毒性的主要靶器官，而上升的原因可能是對富硒植物粉代謝而造成的臟器充血和病變.各臟器病變中最明顯的是肝臟的出血點和黃白色壞死灶以及肺部的嚴重淤血和心臟腫大，推斷出大鼠死亡原因可能是肝淤血和心肺功能紊亂造成的呼吸障礙，這一情況與文獻描述一致[12].肝臟是硒代謝的主要場所，一般硒被代謝后的產(chǎn)物大部分會隨尿液排出，少部分會隨糞便、汗液或從毛發(fā)排出，但當大量的硒被攝入時，硒會被代謝為具揮發(fā)性的二甲基硒化合物而從肺部排出[13-14]，這可能是造成肺部損傷淤血進而造成大鼠死亡的原因.在存活大鼠中有出現(xiàn)腹水這一病征，對其解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟已出現(xiàn)明顯的病變，這可能是因為肝臟是硒代謝的主要場所，而在高劑量的硒攝入情況下，肝臟對其代謝已超出能力范圍，而由于硒在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的各類化合物以及它們參與的各類過氧化反應會產(chǎn)生大量自由基，而過量的自由基可能就會對肝細胞的細胞膜造成損傷，從而造成病變[15].

油菜作為人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾慕?jīng)濟植物以及油料植物，其本身是以食物存在于人們生活中的，因而油菜本身是不會對人體造成損傷和毒性的，而采用硒栽培技術生產(chǎn)的富硒油菜，由于硒元素的加入，其可能會對人體產(chǎn)生危害.在本實驗中，對中毒大鼠的毒性反應和解剖結(jié)果表明，其毒性反應以及中毒的靶器官與文獻描述的硒中毒基本一致，也因而可以初步推斷出富硒油菜的毒性來源于其中的硒元素[16-21].

計算所得該富硒油菜粉的LD50為11.75 g/kg·BW，以硒計為47 mg/kg·BW，依據(jù)國標GB15193.3-2014分類為實際無毒類.胡濱等[16]對亞硒酸鈉在大小鼠體內(nèi)的急性毒性采用改良寇氏法進行了測定，大鼠經(jīng)口灌胃的LD50為11.75 mg/kg·BW，小鼠為3.86 mg/kg·BW[17].胡曉榮[18]等以霍恩法測定大鼠經(jīng)口染毒亞硒酸鈉的LD50為雌雄鼠分別為36.9、42.2 mg/kg·BW.Yang等[19]以霍恩法測定甲基硒半胱氨酸在大鼠中的LD50,雄鼠和雌鼠分別為9.26、12.6 mg/kg·BW.于英杰[20]對硒含量為1 000 mg/kg的富硒酵母進行安全性評價，發(fā)現(xiàn)小鼠口服的LD50為26.38 g/kg·BW(以硒計為26.38 mg/kg·BW).Zhang等[21]測定紅色元素納米硒在小鼠體內(nèi)的LD50為113 mg/kg·BW.可以看出硒及其化合物毒性的大小與其賦存形式有很大關系.本實驗的實驗材料為富硒油菜粉，其主要的硒形態(tài)為有機形式的蛋白質(zhì)硒[22]，以其作為硒補充劑，其安全性要高于以亞硒酸鈉為代表的無機硒和甲基硒半胱氨酸這類有機硒，毒性也小于同為富硒產(chǎn)品的富硒酵母，這可能與鼠種、實驗方法和其在體內(nèi)的吸收和代謝有關；而其安全性小于納米硒，但考慮生產(chǎn)成本，它相較于納米硒更適合硒補充劑產(chǎn)品市場.富硒油菜粉表現(xiàn)出性別的毒性差異，其在雌性體內(nèi)的毒性要大于雄性，這一點與胡曉榮[18]等報道的亞硒酸鈉的急性毒性一致.

3.2 富硒油菜粉對大鼠30 d喂養(yǎng)實驗的影響

富硒油菜粉對大鼠的30 d飼喂實驗中，在0.09 g/kg·BW(以硒計為360 μg/kg·BW)的劑量下，兩種性別的大鼠與對照組相比，在觀察期內(nèi)均無不良反應，飲食狀況、體質(zhì)量變化以及日常活動均表現(xiàn)正常.在該劑量下，對大鼠無明顯毒害作用.

實驗組大鼠與對照組相比各類臟器指數(shù)有少許升高但并無顯著性差異(P>0.05)，這可能是硒的代謝而造成各臟器充血更活躍.肝臟和腎臟是硒在體內(nèi)主要的代謝場所，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)可以反映肝功能好壞的重要指標[23-24]，尿素(Urea)和肌酐(CRE)是反映腎功能好壞的重要指標[25-26].而這幾個指標除雄性組的ALT存在顯著性差異(P<0.05)外，其余各項均不存在顯著性差異(P>0.05)，這可能是因為肝臟是其主要的代謝場所，而ALT的升高是因為硒的代謝造成其肝臟功能更加活躍，但其他血生化指標數(shù)據(jù)又說明該劑量下硒在機體內(nèi)的代謝是在機內(nèi)所能承受的范圍內(nèi)的.

4 結(jié)論

采取霍恩法對富硒油菜粉進行急性毒性實驗，計算其LD50為11.75 g/kg·BW，以硒計為47 mg/kg·BW，毒性主要靶器官為肝臟、腎臟、肺臟、心臟和脾臟，其毒性要小于亞硒酸鈉和甲基硒半胱氨酸，具有成為優(yōu)質(zhì)硒補充劑的潛力；通過30 d喂養(yǎng)預實驗，初步驗證了在人體推薦最大攝入量(400 μg/d)的10倍劑量下，并不會對大鼠的機體代謝產(chǎn)生過大的負擔而造成毒害作用.為后續(xù)富硒油菜粉的遺傳毒性和亞慢性毒性實驗設計提供數(shù)據(jù)支撐，也豐富了硒的毒理學資料，對硒的毒理學研究、硒補充劑的生產(chǎn)和人體合理補充硒有一定指導作用.