曹剛剛，顓孫皖皖，冀利峰，顏萍萍，曾化偉

(1.安徽養(yǎng)生天下生物科技有限公司，安徽 亳州 236831；2.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000)

《植物酵素》(Q/BT 5323-2018)中將食用植物酵素定義為：以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品.酵素中的活性成分包含多個大類，如酵素中的抗氧化和抗腫瘤成分、維生素和礦物質(zhì)、氨基酸和肽類、益生菌和益生元等[1].酵素是果蔬植物的發(fā)酵制品，中國具有幾千年食用發(fā)酵食品的傳統(tǒng)習(xí)慣，比如泡菜、食醋、腐乳等，但“酵素”一詞和相關(guān)產(chǎn)品主要產(chǎn)生和發(fā)展于日本和臺灣地區(qū).大陸地區(qū)近年來對酵素的研究熱度也逐步提高，取得了豐碩的成果.李世燕等[2]研究了不同發(fā)酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響，發(fā)現(xiàn)同時接種酵母菌和乳酸菌的毛酸漿酵素的DPPH自由基清除能力最高達30.97%，SOD酶活性達到409.52 U/mL.袁周率等[3]以糙米為原材料發(fā)酵酵素，研究發(fā)現(xiàn)糙米經(jīng)過發(fā)酵后，典型營養(yǎng)成分如維生素B1、B2、γ-氨基丁酸含量增加.王振斌等[4]研究超聲波對葛根酵素發(fā)酵的影響發(fā)現(xiàn)超聲輔助發(fā)酵有利于酵素中蛋白酶和脂肪酶活性的提高.馮莉等[5]研究了水果酵素對酒精誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護作用及其機制.研究發(fā)現(xiàn)水果酵素對酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有保護作用，灌喂水果酵素后的小鼠病理學(xué)觀察結(jié)果顯示肝臟脂肪變性得到改善，肝臟細胞排列較為整齊，組織結(jié)構(gòu)趨于正常.眾多學(xué)者的研究都從不同的角度反映了食用酵素的價值[6].也進一步推進了關(guān)于酵素的科學(xué)探索，特別是在抗氧化、免疫和抗腫瘤方面.

食用植物酵素的發(fā)酵原材多種多樣，既包括傳統(tǒng)水果、蔬菜，也包含國家衛(wèi)生健康委員會公布的新食品原料和藥食同源的中藥植物[7].不同的原料特征差異很大，有的碳水化合物含量高，有的含有比較多的蛋白質(zhì)，有的富含抗菌物質(zhì)，還有的原料有機酸含量較高.不同的原料在實際發(fā)酵酵素的過程中都會對基質(zhì)中的微生物進行篩選，不同的酵素在制作過程中實際起發(fā)酵作用的微生物可能差別較大，特別是在不外加菌種的自然發(fā)酵狀態(tài)下[8].目前利用高通量測序技術(shù)對不同品種食用酵素的微生物群落結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)鑒定并做綜合對比分析的研究報道相對較少.

酵素屬于發(fā)酵食品，酵素產(chǎn)品必須滿足食品安全國家標準的相關(guān)要求，特別是微生物和致病菌以及污染物限量的要求.不達標的酵素產(chǎn)品可能存在生物和化學(xué)性安全風(fēng)險[9].曹剛剛等[10]通過檢測亳菊酵素發(fā)酵過程中各種重金屬含量，發(fā)現(xiàn)酵素溶液中不同重金屬的含量變化不同.可惜的是，目前關(guān)于酵素的研究多在發(fā)酵工藝、酵素成分和保健價值方面，對于生物安全性特別是酵素中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究相對匱乏.

為此，本研究選擇多種原料，通過測序鑒定不同的酵素微生物的種群情況，分析其微生物指紋圖譜.為食用酵素的生物安全性提供可靠依據(jù)，同時為不同原料酵素的釀造工藝提供發(fā)酵菌種的借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1)材料：蛋白酶K(20 mg/mL)、瓊脂糖、標準DNA水解液、1.10% SDS、酚/氯仿/異戊醇溶液(1∶1∶1)、異丙醇、70%乙醇均為分析純，采購于國藥集團.釀酒酵母購自安琪公司，巴氏醋酸桿菌G3-2為本實驗室自主選育.紅砂糖、糙米、青梅采購于超市，蟲草、余甘子、烏梅、山楂飲片購于亳州藥材大市場.

2)試劑：TE緩沖液(10 mmol/L Tris HCl，0.1 mmol/L EDTA,pH 8.0)，CTAB/NaCl溶液(5%,w/v)，TAE緩沖液(50×)(pH 8.0)，溴酚蘭-甘油指示劑，0.5 μg/mL 溴乙啶染液.

3)培養(yǎng)基：酵母菌種子培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L,新鮮馬鈴薯200 g/L)，醋酸菌種子培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L,酵母粉10 g/L,pH 5.5).

1.2 試驗方法

1.2.1 酵素樣品的發(fā)酵制備 取糙米、青梅、蟲草、余甘子、烏梅、山楂6種原料，按照以下程序操作：① 預(yù)處理：將原料清洗干凈后風(fēng)力吹干.② 厭氧發(fā)酵：以質(zhì)量含量計，將15%的原料、70%的水和10%的紅糖置入密閉容器，添加5%酵母菌液(活細胞數(shù)≥1×106CFU/mL)后30 ℃密封靜置發(fā)酵30 d，然后過濾除渣獲取發(fā)酵液.③ 好氧發(fā)酵：向上述發(fā)酵液中添加5%醋酸菌液(活細胞數(shù)≥1×108CFU/mL)，35 ℃搖床培養(yǎng)，隔日取樣檢測乙醇含量，發(fā)酵至乙醇含量低于0.5%，然后過濾得酵素液，密封保存?zhèn)溆?④ 6種不同原料酵素發(fā)酵樣品進行編號，依次為烏梅(A1)、山楂(A2)、余甘子(A3)、蟲草(B4)、糙米(B5)、青梅(B6).

1.2.2 細菌總DNA提取與PCR擴增 參考文獻[11]利用堿裂解法提取菌株的總DNA.選擇通用引物27F/1492R進行PCR擴增，引物序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(27F)；5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(1492R).PCR程序采用94 ℃變性1 min，之后61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸10 min，保存.

1.2.3 電泳與測序鑒定 采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳.電泳結(jié)束后，用TaKaRa DNA純化試劑盒進行PCR擴增產(chǎn)物純化，將純化后的目的片段送到華大基因公司測序.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析參照張琪等[12]對沙棘酵素發(fā)酵過程中微生物的序列分析試驗方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序質(zhì)量分析

6個樣品中B6(青梅)樣品未能成功提取足量的DNA，推測可能原料酸性過大，隨著發(fā)酵的進行，由于醋酸菌產(chǎn)酸，樣品的pH值會進一步下降，造成發(fā)酵后微生物逐漸衰亡.后續(xù)不再對B6樣品進行分析.

5種樣品的Alpha多樣性曲線和稀釋曲線如圖1所示.由圖1可見，在此測序深度上，各組樣本稀釋性曲線趨向于平穩(wěn)，而等級聚類曲線則逐漸趨于平坦，由此可知，雖然在進一步測序時仍會出現(xiàn)罕見的新型基因型，但大多數(shù)物種已經(jīng)被檢測到.因此，本研究的測序深度足以研究絕大多數(shù)的微生物，具有很高的可信度.由圖1可見B4(蟲草)、B5(糙米)樣品相對微生物群落結(jié)構(gòu)更為多樣，而其他樣品微生物多樣性較低.為簡化分析，后續(xù)僅對B4、B5樣品的測序鑒定結(jié)果進行深入分析.

(a) α多樣性曲線 (b) 等級豐度曲線

2.2 酵素發(fā)酵過程樣品中的細菌分布

不同樣本微生物在“門”水平上的分布如圖2所示.在“門”水平上，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是占主要豐度的兩個門，其中絕大部分是變形菌門(Proteobacteria).這和湯燦輝等[13]研究沙棘酵素自然發(fā)酵過程中的細菌動態(tài)變化結(jié)果相似，這有可能是因為在無氧的條件下，以乳酸菌(厚壁菌門)為代表的兼性厭氧菌大量繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵體系酸化并伴隨著碳源減少.

圖2 不同樣本微生物在“門”水平上的分布 圖3 不同樣本微生物在“屬”水平上的分布

在“屬”水平的主要微生物群落中(圖3)展示相對豐度超過1%的類別，菌群結(jié)構(gòu)較豐富，其中Komagataeibacter(駒形桿菌)是主要的屬.對于B4樣品，其次是Lactobacillus(乳桿菌)相對豐度較高；而B5樣品，其次是Acetobacter(醋桿菌)相對豐度較高.從乳酸菌和醋酸菌的比例來看，乳酸菌較少，代謝活力推測較弱.

B4和B5樣品的共有OTU為222個，B5樣品特有171個，B4樣品166個，如圖4所示.繼續(xù)分別對酵素樣品微生物進行種水平的分析.選擇豐度前40的OTU進行熱圖分析，圖5顯示，B4樣品物種更豐富，其中Lactobacillusacetotolerans、Lactococcuslactis、Bradyrhizobiumelkanii、Bacteroidessartorii等物種豐度都比較高；而對于B5樣品Acetobactermalorum、Lactobacillusacetotolerans、Lactococcuslactis等物種豐度都比較高.從這幾種微生物的發(fā)酵性能分析，B5樣品中的微生物主體為醋酸菌和乳酸菌，屬于醋酸發(fā)酵比較典型的發(fā)酵類型.而B4樣品營養(yǎng)不夠全面，含糖較低，優(yōu)勢微生物物種形成的趨勢較弱，但總體也呈現(xiàn)醋酸發(fā)酵狀態(tài).這種現(xiàn)象出現(xiàn)可能是由于在酵素自然發(fā)酵的過程中，酵素pH值逐漸下降，醋酸菌和乳酸菌等菌株耐酸性較強，逐漸成為優(yōu)勢菌株.這與高慶超等[14]對黑果枸杞在自然發(fā)酵過程中微生物群落動態(tài)研究相似.

圖4 不同樣本微生物的共有和特有OTU

B4.蟲草酵素；B5.糙米酵素.

2.3 發(fā)酵過程樣品中真菌分析

先后進行過3次樣品DNA提取、富集，并放大了樣品規(guī)模，但是都沒有真菌檢出.說明真菌在成品酵素樣品中的分布較少或沒有分布.發(fā)酵初始投入的酵母菌已隨著發(fā)酵衰亡.

2.4 酵素發(fā)酵樣品中微生物的分離和鑒定

根據(jù)微生物分布信息的結(jié)果，采用醋酸菌和乳酸菌篩選培養(yǎng)基，對樣品進行了微生物的分離純化培養(yǎng)，平板涂布分離結(jié)果見圖6.目前共計獲得15株微生物.已進行了菌種鑒定，具體樣品及微生物信息見表1.

a.糙米酵素;b.青梅酵素;c.蟲草酵素;d.烏梅酵素;e.余甘子酵素;f.山楂酵素.

表1 發(fā)酵樣品中分離鑒定得到的微生物

3 討論

本實驗發(fā)酵制作了6種典型的酵素，在類別上包含了水果、中藥和食用真菌.通過提取總DNA并測序鑒定，分析了每種酵素樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)并分離鑒定了主要菌種.總體而言，酵素中豐度最高的3種細菌為駒形桿菌(Komagataeibacter)、醋桿菌(Acetobactermalorum)和乳桿菌(Lactobacillus).6種酵素采用的是相同的發(fā)酵工藝，添加的發(fā)酵菌種都是釀酒酵母和巴氏醋酸桿菌.但實際發(fā)酵成為酵素后卻出現(xiàn)了明顯差異.推測原因，一方面原料雖清洗潔凈但未經(jīng)嚴格殺菌，故原物料會自帶部分微生物進入發(fā)酵，且不同的原料自帶的微生物不同；其次，醋酸發(fā)酵階段是好氧環(huán)境，發(fā)酵容器未密封，發(fā)酵時間又比較長，部分環(huán)境微生物在發(fā)酵過程中通過空氣進入發(fā)酵體系；再次，不同的原料性質(zhì)差異較大，造成不同酵素發(fā)酵基質(zhì)的明顯區(qū)別.比如青梅的有機酸含量很高，會對部分微生物的生長繁殖產(chǎn)生抑制[15]，并在發(fā)酵過程中進行篩選；又比如糙米，營養(yǎng)成分更均衡，碳水化合物含量很高[16]，發(fā)酵時提供了更多的碳源，故糙米酵素中微生物種群密度高且多樣.但是不管是哪種酵素，發(fā)酵的總體方向都是醋酸發(fā)酵，糙米、余甘子和烏梅三種酵素同時伴隨有比較強的乳酸發(fā)酵.

目前國內(nèi)酵素行業(yè)實際生產(chǎn)的酵素大多產(chǎn)自手工慢發(fā)酵.與快速攪拌罐發(fā)酵不同，這種傳統(tǒng)的發(fā)酵受到人為和環(huán)境的影響更大，發(fā)酵周期更長，產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全也更難把控[17].這也是本實驗采用類似模式制作酵素的原因，是為了實際生產(chǎn)制造提供借鑒.通過高通量測序技術(shù)對多種酵素的微生物群落結(jié)構(gòu)的分析驗證了酵素釀造的微生物多樣性.平板培養(yǎng)和鑒定未發(fā)現(xiàn)霉菌和常見致病菌如大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，也在一定程度上說明了規(guī)范的傳統(tǒng)發(fā)酵不會出現(xiàn)常見的微生物安全風(fēng)險.原因可能源自兩方面：一是發(fā)酵時添加菌種，數(shù)量占優(yōu)，具有競爭優(yōu)勢；二是發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和醋酸，發(fā)酵基質(zhì)對多數(shù)微生物生長不利.現(xiàn)階段，多數(shù)酵素生產(chǎn)企業(yè)多采用工業(yè)化菌種或自制菌種，在發(fā)酵時添加菌種，并根據(jù)產(chǎn)品要求制定發(fā)酵工藝規(guī)范和標準.部分消費者家庭自制酵素，往往不添加發(fā)酵菌種，發(fā)酵過程也無法實施監(jiān)控，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量.同時，致病菌、真菌毒素等等也可能產(chǎn)生，從而引發(fā)食品安全風(fēng)險[9].

當下國內(nèi)酵素行業(yè)還處于起步發(fā)展階段，相應(yīng)的科學(xué)研究多針對某些品種酵素的發(fā)酵工藝和抗氧化等保健價值[18].本文應(yīng)用高通量測序技術(shù)從微生物群落結(jié)構(gòu)和食品安全的角度，通過對多種原料發(fā)酵酵素的微生物種群分析，彌補了現(xiàn)有研究的不足.未來隨著酵素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和酵素產(chǎn)品需求的增加，傳統(tǒng)發(fā)酵的模式無法滿足的情況下，現(xiàn)代快速發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用勢必會越來越多.本文分離鑒定了發(fā)酵完成的酵素的主要微生物菌種，也為未來實現(xiàn)純培養(yǎng)工藝提供菌種方面的參考[19].