張韻函，謝盛言，何珊珊

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遵義市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遵義 563000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌疾病，患者可出現(xiàn)多種代謝紊亂癥狀，如胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能障礙、葡萄糖不耐受、血脂異常和肥胖等[1-2]?；颊邇?nèi)分泌激素如卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌二醇(estradiol，E2)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、孕酮(progesterone，P)、睪酮(testosterone，T)的分泌紊亂，可能與受精率降低及胚胎發(fā)育異常有關(guān)[3]。許多研究證實，在PCOS患者中，CRP與胰島素抵抗、體質(zhì)量和脂肪含量呈正相關(guān)。此外，IL-6在卵巢成熟和胚胎著床過程中發(fā)揮重要作用[4]。TNF-α是一種能夠刺激卵泡膜細(xì)胞增殖的炎性因子，在卵泡和黃體期對卵巢的正常活動起重要調(diào)節(jié)作用，可在巨噬細(xì)胞、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、閉鎖卵巢和卵泡膜細(xì)胞中檢測到其基因表達(dá)[5]。

姜黃是一種生長在東南亞熱帶地區(qū)的植物，姜黃素是一種提取自姜黃根莖的黃色多酚類化合物[6]。近期的研究結(jié)果表明，姜黃素具有強大的抗炎活性，能夠降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平，在多種炎癥相關(guān)性疾病中均有良好效果[7]。鑒于以上因素，研究比較姜黃素對PCOS大鼠模型血清性激素(E2、LH、FSH、P、T)及組織中TNF-α、IL-6和CRP水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物隨機取70只3周齡雌性SD大鼠，于SPF條件下給予12 h/12 h晝夜交替環(huán)境。室溫控制在(25±1) ℃，于實驗前1周對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，每天定時供應(yīng)食物和水。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及樣本的制備 將70只雌性SD大鼠隨機分為正常組(N組)(10只)及PCOS造模組(60只)。模型組于皮下注射60 mg/kg的5%脫氫表雄酮，連續(xù)注射20 d。第21天起自模型組和正常組中各隨機抽取5只大鼠行陰道涂片，觀察動情周期變化，連續(xù)觀察3個動情周期(約15 d)，于造模以及藥物干預(yù)期間每日用電子天平稱量大鼠體質(zhì)量。于第15天自大鼠球后靜脈叢取血、離心、分離血清，采用放射免疫法檢測血清性激素水平及空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)。顯微鏡下觀察并判斷動情狀態(tài)：動情前期的涂片出現(xiàn)有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；動情期涂片則顯示無核角化細(xì)胞或偶有少量上皮細(xì)胞；動情后期出現(xiàn)有核上皮細(xì)胞、無核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞；動情間期的涂片中存在大量白細(xì)胞，當(dāng)大鼠陰道涂片連續(xù)出現(xiàn)角化細(xì)胞、動情周期和性激素水平紊亂及FINS水平升高提示造模成功。隨后將造模組大鼠根據(jù)動情周期結(jié)果分為4組， 即PCOS模型組(PCOS組)、藥物治療高劑量組(A組)、中劑量組(B組)及低劑量組(C組)，隨后進(jìn)行為期一個月的腹腔姜黃素注射治療(高劑量組100 mg/ kg、中劑量組75mg/ kg、低劑量組50 mg/ kg)，正常組和對照組均注射等量生理鹽水。姜黃素連續(xù)治療30 d后，麻醉各組大鼠并自腹主動脈處采血，離心取上清液備用；處死大鼠取雙側(cè)卵巢，剝除多余脂肪組織并用電子天平稱重，計算卵巢指數(shù)[大鼠卵巢指數(shù)=(大鼠卵巢濕重/大鼠體質(zhì)量)× 100%]；取一側(cè)大鼠卵巢石蠟包埋以行免疫組化檢測，另一側(cè)用錫紙包埋后迅速放入液氮中保存。

1.2.2 ELISA檢測各組大鼠血清性激素水平 按照ELISA檢測試劑盒說明書測定大鼠血清中性激素水平(E2、LH、FSH、P、T)，于酶標(biāo)儀測定光密度D(450 nm)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法染色 切片脫蠟，抗原修復(fù)后加入稀釋好的抗TNF-α、IL-6抗體(稀釋度為TNF-α 1∶100，IL-6 1∶200)，加入適量生物素標(biāo)記的二抗工作液，顯色劑顯色，流水充分漂洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下染色結(jié)果示卵巢組織樣本中細(xì)胞胞質(zhì)呈淡黃色或黃色顆粒狀著色，采用IPP 6.0軟件于相同條件下檢測每張組織切片中TNF-α、IL-6表達(dá)的積分光密度(integrated optical density， IOD)。

1.2.4 ELISA檢測各組大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA檢測試劑盒說明書測定大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α水平，于酶標(biāo)儀測定光密度[D(450 nm)]值。

1.2.5 血糖檢測儀檢測各組大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)、FINS和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)水平 用血糖檢測儀檢測各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動情周期的測量與N組相比，PCOS組大鼠動情周期不規(guī)律且出現(xiàn)紊亂，其中動情前期、動情期持續(xù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但動情間期及后期顯著延長 (P<0.05)，經(jīng)過藥物治療動情周期紊亂及延長的情況得到有效改善。詳見表1。

表1 各組大鼠動情周期變化情況

2.2 各組大鼠血清E2、LH、FSH、P、T水平及卵巢指數(shù)和大鼠體質(zhì)量的檢測結(jié)果顯示，PCOS組與N組比較，大鼠血清FSH、P水平顯著降低(P<0.05)，E2、LH、T水平顯著升高，大鼠體質(zhì)量和卵巢指數(shù)也顯著升高(P<0.05)；藥物處理后，各治療組與PCOS組比較，血清FSH、P水平顯著升高，E2、LH、T水平顯著降低，大鼠體質(zhì)量和卵巢指數(shù)也顯著降低(均P<0.05，表2、表3)。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較

表3 各組大鼠卵巢指數(shù)及體質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平的檢測PCOS組大鼠血清中FBG、FINS及HOMA-IR水平較N組顯著升高(P<0.05)；各藥物治療組大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平與PCOS組相比下降，其中高、中劑量治療組水平下降顯著(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平比較

2.4 各組大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平的檢測與N組相比，PCOS組血清CRP、IL-6和TNF-α水平顯著升高，藥物干預(yù)后各治療組血清CRP、IL-6、TNF-α與PCOS組相比均下降，其中高、中劑量治療組下降顯著(均P<0.05，表5)。

表5 各組大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平比較

2.5 TNF-α在卵巢組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，TNF-α蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及顆粒黃體細(xì)胞中表達(dá)。與PCOS組相比，N組和藥物干預(yù)組TNF-α在卵泡顆粒層的表達(dá)很少且在卵泡膜中不表達(dá)，但在卵泡液中有明顯的沉淀(棕色)。與PCOS組相比，藥物治療組卵巢、卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞周圍TNF-α表達(dá)減少，其中高劑量藥物治療組效果最佳(P<0.05)，卵巢中TNF-α表達(dá)量顯著下降。詳見圖1、表6。

注：A.N組；B.POCS組；C.A組；D.B組；E.C組。圖1 免疫組織化學(xué)染色分析各組大鼠卵巢組織中TNF-α的表達(dá)(×200)

表6 各組大鼠卵巢組織中TNF-α表達(dá)水平的比較

2.6 IL-6在卵巢組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，與N組比較，PCOS組卵巢間質(zhì)、腔前卵泡和顆粒層中IL-6表達(dá)顯著增加(P<0.05)；藥物治療后各組間質(zhì)細(xì)胞、卵泡膜、顆粒卵泡中IL-6的表達(dá)較PCOS模型組顯著降低(P<0.01)，其中高劑量藥物治療組作用最佳，卵巢中IL-6表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。詳見圖2、表7。

表7 各組大鼠卵巢組織中IL-6表達(dá)水平的比較

注：A.N組；B.POCS組；C.A組；D.B組；E.C組。圖2 免疫組織化學(xué)染色分析各組大鼠卵巢組織中IL-6的表達(dá)(×200)

3 討論

PCOS患者治療的總體目標(biāo)是幫助婦女正常排卵，降低雄激素水平、體質(zhì)量及糖尿病和心血管疾病風(fēng)險[8]。一般來說，大多數(shù)PCOS患者卵巢內(nèi)有多個小卵泡，這些卵泡通常對促性腺激素敏感。Van H等[9]的研究提示PCOS患者卵巢和內(nèi)臟脂肪厚度增加。本研究PCOS模型組大鼠體質(zhì)量增加，動情周期出現(xiàn)紊亂及延長現(xiàn)象，卵巢指數(shù)上升，說明建模成功。Smith等[10]的研究提示PCOS患者卵泡顆粒細(xì)胞可能存在異常，內(nèi)臟脂肪量的增加導(dǎo)致血清TNF-α水平上升。Eleni等[11]報道稱PCOS患者血清TNF-α水平升高，可能是IL-6刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生的，為探討IL-6、高雄激素血癥與人體代謝改變的關(guān)系，進(jìn)一步了解PCOS相關(guān)內(nèi)分泌代謝異常的意義，本研究測定了PCOS大鼠性激素水平、代謝相關(guān)指標(biāo)及慢性炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α和CRP的水平。

黃紅藝等[12]研究表明，CRP水平升高與胰島素抵抗有關(guān)，增加了2型糖尿病及心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險。Ramezani等[13]的研究表明，PCOS患者血清中CRP水平升高，提示患者體內(nèi)存在慢性炎癥，他們還發(fā)現(xiàn)PCOS患者CRP水平升高與肥胖有關(guān)。Cabus U等[14]2020年的研究結(jié)果顯示，CRP水平的降低與接受二甲雙胍治療的PCOS患者代謝癥狀的減輕是一致的。姜黃素的治療與降低CRP水平有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)符合姜黃素對該綜合征的治療作用。有研究表明，PCOS患者血清炎性因子(IL-6和IL-18)水平顯著升高，與胰島素敏感性參數(shù)呈正相關(guān)；姜黃素調(diào)節(jié)機體代謝以及內(nèi)分泌功能，有助于改善PCOS癥狀[15]。體外研究表明，炎性因子能夠上調(diào)卵巢卵泡膜細(xì)胞中的類固醇生成酶水平，炎性因子也能刺激卵泡膜細(xì)胞的增殖。此外，異常的炎癥反應(yīng)可能會損害排卵過程的精細(xì)調(diào)節(jié)。2009年，Maryam T等[16-17]研究顯示姜黃素處理對卵巢癌細(xì)胞起到抗增殖、促凋亡和激素分泌抑制等作用。這些作用不僅在小鼠在體與離體卵巢細(xì)胞中可觀察到，也可在人卵巢細(xì)胞中觀察到。脂肪組織源性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)的表達(dá)可能是維持慢性炎癥的重要因素，內(nèi)臟脂肪組織的堆積可能是支持代謝綜合征和慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。Hu X等[18]的研究結(jié)果提示，姜黃素抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少激素的產(chǎn)生和釋放，因此，他們建議將姜黃素作為新的治療方法。Wang C等[19]發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過抑制胰蛋白酶的活性和NF-κB信號通路中細(xì)胞的凋亡以減少卵巢組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素治療能降低卵巢指數(shù)減少原始卵泡和黃體數(shù)量，并在治療后改善動情周期及性激素水平的紊亂，調(diào)節(jié)血糖，降低炎性因子在血清及組織中的表達(dá)，可能成為臨床治療PCOS的一種新方法。