劉睿，郭翀，彭江濤，胡忠波，郭科，張?chǎng)畏?，吳淑華，李建民

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，濱州 256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，濱州 256603)

癲癇是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，表現(xiàn)為慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)。約三分之一的癲癇患者對(duì)傳統(tǒng)抗癲癇藥物產(chǎn)生耐藥，嚴(yán)重和控制不良的癲癇患者會(huì)出現(xiàn)叢集性發(fā)作并在短期內(nèi)再發(fā)，增加患者軀體及腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致其沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。識(shí)別短期內(nèi)癲癇再發(fā)患者，及時(shí)提供干預(yù)，可以幫助他們改善病情[2]。然而，臨床上目前尚無(wú)有效的生物學(xué)標(biāo)志物可用于短期內(nèi)癲癇再發(fā)人群的預(yù)估。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，新近研究表明，多種炎癥介質(zhì)在癲癇的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。其中，NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3， NLRP3)炎癥小體的作用引起了人們的關(guān)注。NLRP3炎癥小體主要由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和磷酸化的Caspase-1前體組成[4]。NLRP3炎癥小體是免疫炎癥反應(yīng)的重要組成部分，通過(guò)激活炎癥相關(guān)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大。NLRP3炎癥小體及其下游炎癥介質(zhì)活化的Caspase-1和IL-18在腦缺血再灌注損傷、阿爾茲海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有明顯的促炎作用。最新研究表明，NLRP3炎癥小體在急性癲癇模型中表達(dá)水平升高[5]。本課題組的前期研究也證明，慢性癲癇大鼠腦組織中NLRP3蛋白、Caspase-1和IL-18表達(dá)水平升高，抑制其表達(dá)可以降低癲癇發(fā)作強(qiáng)度，起到神經(jīng)保護(hù)作用[6]。但NLRP3水平與短期內(nèi)癲癇再發(fā)的關(guān)系尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究通過(guò)分析成人癲癇患者外周血中NLRP3水平與短期內(nèi)癲癇再發(fā)的關(guān)系，探究NLRP3水平對(duì)短期內(nèi)疾病再發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為臨床提早識(shí)別及防治癲癇發(fā)作提供可能的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018年9月—2019年8月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的成人全面強(qiáng)直-陣攣性癲癇發(fā)作患者61例。其中，男性35例，女性26例，年齡(57.56±13.06)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18周歲以上，于癲癇發(fā)作24 h內(nèi)就診。(2)根據(jù)家屬描述，患者發(fā)病年齡21～83歲，發(fā)病時(shí)出現(xiàn)發(fā)作性意識(shí)喪失，伴四肢強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，結(jié)合既往癲癇發(fā)作史及入院后影像學(xué)和腦電圖檢查，所有患者病情均符合2017年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟制定的《癲癇診治指南》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均為癲癇全面強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。(3)排除癲癇發(fā)作前有嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能障礙等疾病的患者及拒絕參加研究者，不能配合完成隨訪者。(4)入院患者均為急性發(fā)作入院，非叢集性發(fā)作癲癇患者給予口服丙戊酸鈉或卡馬西平治療[丙戊酸鈉服用劑量為0.2 g/次，3次/d；卡馬西平0.1 g/次，3次/d；觀察期間(7 d內(nèi))持續(xù)服藥]。叢集性發(fā)作癲癇患者給予苯巴比妥鈉注射治療(苯巴比妥鈉注射液100 mg，肌注，早晚各1次，連續(xù)治療2 d；后改為1次/晚，連續(xù)治療3 d后停用)，同時(shí)給予口服或鼻飼丙戊酸鈉(0.2 g/次，3次/d)或卡馬西平(0.1 g/次，3次/d)[觀察期間(7 d內(nèi))持續(xù)服藥]。研究均獲得受試者或其家屬知情同意，本研究獲得濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的采集 詳細(xì)記錄入選患者臨床資料，包括性別、年齡、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[NLRP3水平、血糖、血鈣、血鎂、白細(xì)胞(white blood cell， WBC)計(jì)數(shù)、膽固醇、尿酸]和癲癇分型(叢集性發(fā)作或短期內(nèi)癲癇再發(fā))。

1.2.2 叢集性發(fā)作及短期內(nèi)癲癇再發(fā)作的判定 根據(jù)臨床癥狀、腦電圖及影像學(xué)檢查結(jié)果，患者24 h內(nèi)發(fā)作1次為非叢集性發(fā)作；24 h內(nèi)發(fā)作≥2次為叢集性發(fā)作[8]。所有患者均經(jīng)住院觀察或門診隨訪7 d，第1次癲癇發(fā)作后7 d內(nèi)再次發(fā)作判定為短期內(nèi)癲癇再發(fā)。

1.2.3 患者血清NLRP3蛋白水平的檢測(cè) 入院后采集患者空腹靜脈血5 mL，以1 500×g離心10 min后分離上清液，ELISA檢測(cè)血清樣本中NLRP3蛋白水平。具體為向包被鼠抗人NLRP3單抗的微孔中依次加入患者血清，再與兔抗人/小鼠NLRP3-HRP抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)徹底漂洗后加入底物3，3＇，5，5＇-四甲基聯(lián)苯胺(3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine， TMB)顯色。用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度D(450 nm)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中NLRP3蛋白濃度(上述所用人NLRP3 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 成人癲癇患者再發(fā)組與未再發(fā)組一般資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及NLRP3水平比較61例成人癲癇患者中，叢集性發(fā)作者30例，非叢集性發(fā)作者31例；隨訪7 d，有13例癲癇患者再次發(fā)作，其中叢集性發(fā)作者10例(76.92%)，非叢集性發(fā)作者3例(23.08%)；再發(fā)組與未再發(fā)組癲癇患者比較，性別、血糖、血鈣、血鎂、WBC計(jì)數(shù)、膽固醇和尿酸等指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；2組之間叢集性發(fā)作率、年齡、NLRP3炎癥小體水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.05，表1)。

表1 成人癲癇患者短期再發(fā)組與未再發(fā)組一般資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及NLRP3炎性小體水平比較

2.2 叢集性與非叢集性發(fā)作癲癇患者NLRP3水平及疾病短期再發(fā)率的比較叢集性發(fā)作癲癇患者NLRP3水平、癲癇短期再發(fā)率均顯著高于非叢集性發(fā)作癲癇患者(均P<0.05，表2)。

表2 叢集性與非叢集性發(fā)作癲癇患者NLRP3水平及疾病短期再發(fā)率的比較

2.3 成人癲癇后短期內(nèi)再發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析以成人癲癇后短期內(nèi)再發(fā)情況為因變量，上述具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的相關(guān)指標(biāo)(年齡、叢集性發(fā)作率、NLRP3水平)為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，血清NLRP3水平及年齡是成人短期內(nèi)(≤7 d)癲癇再發(fā)作的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR值分別為1.104、0.925,95%CI1.021～1.193、0.871～0.982,均P<0.05, 表3)。

表3 患者短期內(nèi)癲癇再發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 NLRP3水平預(yù)測(cè)成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的價(jià)值NLRP3水平預(yù)測(cè)成人癲癇后短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特異度64.6%；NLRP3水平預(yù)測(cè)非叢集性癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.929，95%CI0.827～1.031，截止值94.62 μg/L，敏感度100.0%，特異度85.7%；NLRP3水平預(yù)測(cè)叢集性癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.675，95%CI0.448～0.902，截止值98.85 μg/L，敏感度60.0%，特異度25.0%。詳見(jiàn)圖1。

注：A. NLRP3炎癥小體水平預(yù)測(cè)總體癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的ROC曲線；B. NLRP3炎癥小體水平預(yù)測(cè)非叢集性癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的ROC曲線；C. NLRP3炎癥小體水平預(yù)測(cè)叢集性癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的ROC曲線。圖1 NLRP3炎癥小體水平預(yù)測(cè)成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的ROC曲線

3 討論

癲癇是一種多危險(xiǎn)因素并具強(qiáng)烈遺傳傾向的復(fù)雜病癥[9]，大約每27人中就有1人在一生中的某個(gè)時(shí)候癲癇發(fā)作。癲癇患者過(guò)早死亡的風(fēng)險(xiǎn)很大，多達(dá)三分之一的過(guò)早死亡直接(如癲癇持續(xù)狀態(tài)、癲癇所致腦損傷、癲癇所致猝死)或間接(如吸入性肺炎、自殺、溺水)與癲癇相關(guān)[10]，然而近乎一半的癲癇患者在目前的治療方案下病情沒(méi)能得到充分緩解[11]。一旦首次發(fā)作，癲癇將會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生巨大的心理和生理影響。所以在初發(fā)后，迫切需要對(duì)患者病情進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u(píng)估和干預(yù)。但在一般人群中，癲癇治療后的復(fù)發(fā)率差異很大。有文獻(xiàn)證明，局灶性發(fā)作、夜間發(fā)作、腦損傷既往史、癲癇家族史、神經(jīng)系統(tǒng)檢查異常、腦電圖癲癇樣放電和神經(jīng)影像學(xué)異常都預(yù)示著癲癇再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加[12-13]。然而，對(duì)成人癲癇患者短期內(nèi)(≤7 d)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)生物學(xué)標(biāo)志物的探尋尚未見(jiàn)明確報(bào)道。

癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)過(guò)程可能是導(dǎo)致癲癇病理生理變化的1個(gè)重要機(jī)制[14-15]。炎癥介質(zhì)可以通過(guò)激活特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體如N-甲基-D-天冬氨酸受體和TLR而觸發(fā)神經(jīng)元過(guò)度興奮，最終導(dǎo)致癲癇發(fā)作及再發(fā)的可能性增加[16]。NLRP3炎癥小體是目前研究的熱點(diǎn)，它是免疫炎癥反應(yīng)的重要組成部分，能識(shí)別內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)并激活Caspase-1，繼而活化IL-1β等細(xì)胞因子，參與諸多慢性疾病的非感染性炎癥反應(yīng)過(guò)程[17]。有研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3主要定位于小膠質(zhì)細(xì)胞，其被激活后形成NLRP3炎癥復(fù)合體，觸發(fā)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)程并誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。癲癇發(fā)作又加重了血腦屏障的損傷，促進(jìn)了腦部炎癥反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放炎性細(xì)胞因子如IL-1β，進(jìn)一步降低癲癇發(fā)作閾值，進(jìn)而導(dǎo)致大腦的興奮性增加和癲癇的反復(fù)發(fā)作[18-19]。因此，作者推測(cè)NLRP3炎癥小體可能對(duì)短期內(nèi)癲癇再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)具有預(yù)測(cè)價(jià)值。而本研究結(jié)果也證實(shí)，成人短期內(nèi)癲癇再發(fā)組血清NLRP3水平較非再發(fā)組顯著升高(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析也顯示，NLRP3水平是成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。它預(yù)測(cè)成人癲癇后短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特異度64.6%。上述結(jié)果說(shuō)明，NLRP3水平可以較好地預(yù)測(cè)成人短期內(nèi)癲癇再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

癲癇叢集性發(fā)作的定義為24 h內(nèi)癲癇發(fā)作≥2次，患有未經(jīng)治療的叢集性癲癇的患者生活質(zhì)量明顯下降，癲癇持續(xù)狀態(tài)、急診和住院風(fēng)險(xiǎn)更大，其癲癇再發(fā)率也更高[20]。本研究也證實(shí)，叢集性發(fā)作癲癇患者血清NLRP3水平[(95.66±13.76) μg/L]、短期再發(fā)率(33.33%)均顯著高于非叢集性發(fā)作癲癇患者[(87.85±7.90) μg/L、再發(fā)率9.68%](均P<0.05)，這說(shuō)明叢集性發(fā)作的患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平升高，導(dǎo)致短期內(nèi)再發(fā)的可能性顯著增加(均P<0.05)。然而，多因素Logistic回歸分析顯示叢集性發(fā)作不是成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而且NLRP3水平預(yù)測(cè)非叢集性癲癇后短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.929，預(yù)測(cè)叢集性癲癇后短期內(nèi)再發(fā)的AUC為0.675。作者推測(cè)這可能與病例數(shù)相對(duì)較少，且叢集性癲癇發(fā)作患者入院時(shí)病情相對(duì)較重有關(guān)。此外，應(yīng)用長(zhǎng)效抗癲癇藥物苯巴比妥鈉對(duì)后續(xù)疾病發(fā)作有所影響，從而影響NLRP3預(yù)測(cè)癲癇后短期內(nèi)再發(fā)的精確性。

另外，研究顯示癲癇再發(fā)組年齡小于癲癇非再發(fā)組，多因素Logistic回歸分析也顯示年齡是成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，需要引起重視。本研究認(rèn)為，這可能與年齡小者大多為原發(fā)性癲癇，病情與病史長(zhǎng)、熬夜、疲勞、服藥不規(guī)律，而年齡大者多為卒中后癲癇有關(guān)。有研究表明，NLRP3激活劑包括膽固醇和尿酸結(jié)晶，子癇前期患者血清總膽固醇和尿酸水平升高[21]。但本研究結(jié)果顯示癲癇再發(fā)組和未再發(fā)組患者血清膽固醇和尿酸水平未見(jiàn)明顯異常。由于病例數(shù)相對(duì)較少，未能對(duì)膽固醇或尿酸針對(duì)NLRP3炎癥小體的影響進(jìn)行深入分析。

本研究不足之處是研究病例數(shù)相對(duì)較少，觀察時(shí)間短，對(duì)NLRP3水平檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)不夠多，未能完整地展現(xiàn)出患者再發(fā)癲癇前后的NLRP3水平變化曲線。同時(shí)，樣本既包括原發(fā)性癲癇，也包括繼發(fā)性癲癇，其NLRP3炎癥小體的激活機(jī)制可能不同。另外，納入患者均為入院患者，而門診患者被排除在外，這些患者病情相對(duì)較重，對(duì)短期癲癇再發(fā)的發(fā)生率可能也有影響。

綜上所述，NLRP3水平升高是成人癲癇患者短期內(nèi)再發(fā)的重要危險(xiǎn)因素，對(duì)短期內(nèi)癲癇再發(fā)具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。NLRP3可能是新的癲癇治療靶點(diǎn)，臨床上其檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，具有較大的實(shí)用價(jià)值，值得應(yīng)用及推廣。