郭銀謀，王玉梅，陳貢斌，岳培茹，周威

(商丘市第一人民醫(yī)院 腫瘤一科，商丘 476100)

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移和侵襲性較強(qiáng)，患者確診時(shí)多為晚期，且目前年輕人結(jié)腸癌的死亡率有升高趨勢[1]?，F(xiàn)階段，結(jié)腸癌的分子靶向治療給中晚期結(jié)腸癌患者的治療提供了新的選擇。結(jié)腸癌中差異表達(dá)的miRNA可能是結(jié)腸癌的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[2]。研究表明，miR-3619-5p可抑制惡性腫瘤進(jìn)展，在前列腺癌[3]、乳腺癌[4]、膀胱癌[5]中表達(dá)下調(diào)。本研究通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，6磷酸果糖2激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，PFKFB3)可能是miR-3619-5p的靶基因。PFKFB3已被證明在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，其miRNA水平的高表達(dá)與患者惡性表型及不良預(yù)后相關(guān)[6]。但miR-3619-5p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)、作用及其與PFKFB3的關(guān)系目前尚未可知。因此，本研究假設(shè)miR-3619-5p通過靶向PFKFB3影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并對此進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年3月—2019年3月于河南省商丘市第一人民醫(yī)院病理檢查確診為結(jié)腸癌的患者手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及癌旁組織(距離結(jié)腸癌組織邊緣>1.5 cm)各35例，患者男性16例、女性19例，年齡(49.2±16.9)歲。所有患者術(shù)前未接受放療和化療，并對研究知情同意。

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS購自Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑TRIzol、Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PFKFB3過表達(dá)載體(pcDNA-PFKFB3)、PFKFB3抑制物(si-PFKFB3)、miR-3619-5p模擬物(miR-3619-5p)、miR-3619-5p抑制劑(anti-miR-3619-5p)、陰性對照(pcDNA、si-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、PFKFB3野生型(WT-PFKFB3)和突變型(MUT-PFKFB3)雙熒光素酶報(bào)告載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；PFKFB3、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)和GAPDH抗體購自Abcam公司；Transwell板購自Corning公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自Promega公司；qRT-PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116常規(guī)復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置于飽和、濕潤、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 miR-3619-5p和PFKFB3 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑提取結(jié)腸癌組織樣本、癌旁組織和HCT116細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以得到的cDNA為模板，按照qRT-PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)，檢測miR-3619-5p和PFKFB3 mRNA水平。運(yùn)用2-ΔΔ Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。qRT-PCR引物詳見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞稀釋至1×l06個(gè)/mL，取100 μL接種于6孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)70%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。將載體miR-NC、miR-3619-5p、si-NC、si-PFKFB3、anti-miR-NC、anti-miR-3619-5p、miR-3619-5p+pcDNA、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3分別轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，分別記為miR-NC組、miR-3619-5p組、si-NC組、si-PFKFB3組、anti-miR-NC組、anti-miR-3619-5p組、miR-3619-5p+pcDNA組、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，檢測miR-3619-5p和PFKFB3的表達(dá)以進(jìn)行轉(zhuǎn)染驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞增殖的CCK-8試驗(yàn)檢測 將miR-NC組、miR-3619-5p組、si-NC組、si-PFKFB3組、miR-3619-5p+pcDNA組、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組HCT116細(xì)胞以100 μL/孔(1×104個(gè)/mL)接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)至24、48和72 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定光密度[D(450 nm)]值。

1.2.5 PFKFB3、Cyclin D1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白的Western blotting檢測 收集上述“1.2.3”項(xiàng)分組的處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用SDS-PAGE分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)PVDF膜，然后將膜置于脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h，洗膜后分別加入稀釋的一抗：PFKFB3抗體(1∶1 000)、Cyclin D1抗體(1∶2 000)、p21抗體(1∶1 500)、MMP-2抗體(1∶2 000)、MMP-9抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜2次，加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，顯影，拍照。以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白的表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲的Transwell試驗(yàn)檢測 (1)遷移試驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)過夜，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1×106個(gè)/mL，然后取100 μL加入Transwell上層小室，下層培養(yǎng)孔加入500 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后用棉簽拭去上層小室內(nèi)層未遷移的細(xì)胞，采用多聚甲醛固定遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取平均數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。(2)侵襲試驗(yàn)：將液化的Matrigel用低溫RPMI 1640 培養(yǎng)液以1∶3比例稀釋，取50 μL平鋪入Transwell上層小室，在37 ℃固化3 h，之后的步驟同遷移試驗(yàn)。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 根據(jù)上述“1.2.3”項(xiàng)的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的PFKFB3野生型(WT-PFKFB3)和突變型(MUT-PFKFB3)雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-NC或miR-3619-5p共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-3619-5p和PFKFB3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中miR-3619-5p水平顯著降低(P<0.05，圖1A)，PFKFB3 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，圖1B、C)。

注：A. miR-3619-5p的表達(dá)分析；B. PFKFB3 mRNA的表達(dá)分析；C.PFKFB3蛋白的表達(dá)分析, N1、N2、N3為癌旁組織， T1、T2、T3為結(jié)腸癌組織。與癌旁組織比較，*P<0.05。圖1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-3619-5p和PFKFB3的表達(dá)

2.2 miR-3619-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響過表達(dá)miR-3619-5p組的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中miR-3619-5p的水平升高(P<0.05)，細(xì)胞在24、48和72 h的D值均顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。這說明過表達(dá)miR-3619-5p可以抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。詳見圖2。

2.3 抑制PFKFB3表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響轉(zhuǎn)染si-PFKFB3組的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中PFKFB3的水平降低(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，p21表達(dá)量升高(P<0.05)，細(xì)胞在24、48和72 h的D值均顯著降低(P<0.05)，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。這說明抑制PFKFB3可以抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。詳見圖3。

注：A.抑制PFKFB3表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 PFKFB3、Cyclin D1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響；B.抑制PFKFB3表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響；C.抑制PFKFB3表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)。與si-NC組比較，*P<0.05。圖3 抑制PFKFB3表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 miR-3619-5p靶向調(diào)控PFKFB3的表達(dá)StarBase預(yù)測結(jié)果顯示，miR-3619-5p與PFKFB3序列中含有互補(bǔ)的位點(diǎn)(圖4A)。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-3619-5p組WT-PFKFB3的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而MUT-PFKFB3的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化(圖4B)。Western blotting結(jié)果顯示，上調(diào)miR-3619-5p可降低PFKFB3水平，下調(diào)miR-3619-5p可顯著提高PFKFB3水平(圖4C)。這說明miR-3619-5p可靶向負(fù)調(diào)控PFKFB3的表達(dá)。

注：A. PFKFB3的3＇-UTR中含有與miR-3619-5p互補(bǔ)的核苷酸序列；B. 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)；C. miR-3619-5p調(diào)控PFKFB3蛋白的表達(dá)。與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05。圖4 miR-3619-5p靶向調(diào)控PFKFB3的表達(dá)

2.5 PFKFB3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-3619-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲的作用為確認(rèn)miR-3619-5p是否通過調(diào)控PFKFB3影響結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的惡性生物學(xué)行為，在上調(diào)miR-3619-5p的同時(shí)過表達(dá)PFKFB3。結(jié)果顯示，與miR-3619-5p+pcDNA組比較，miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組的HCT116細(xì)胞中PFKFB3的水平增加，細(xì)胞D值在24、48和72 h均升高，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)增加，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高，p21蛋白水平降低(P<0.05)。這說明過表達(dá)PFKFB3可逆轉(zhuǎn)miR-3619-5p過表達(dá)對HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。詳見圖5。

注：A.PFKFB3和細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)；B. PFKFB3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3619-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的作用；C.PFKFB3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3619-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116遷移和侵襲的作用 (結(jié)晶紫染色，×200)。與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-3619-5p+pcDNA組比較，#P<0.05。圖5 PFKFB3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-3619-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

miRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌患者血清或腫瘤組織中有多種miRNA表達(dá)異常，這可能有助于結(jié)腸癌的診斷、治療、臨床療效評估和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-3619-5p在非小細(xì)胞肺癌患者血清[9]、順鉑耐藥的皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous-cell carcinoma，CSCC)細(xì)胞[10]中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌的作用，其過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的生長和侵襲，還可抑制CSCC細(xì)胞的增殖和順鉑抵抗。在甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)中，miR-3619-5p是LINC01410的作用靶點(diǎn)，LINC01410/miR-3619-5p/FOXM1正反饋環(huán)可調(diào)節(jié)TC細(xì)胞增殖和凋亡[11]。以上研究結(jié)果均說明，miR-3619-5p與惡性腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，但其在結(jié)腸癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究分別檢測了35例結(jié)腸癌組織和癌旁組織，結(jié)果顯示miR-3619-5p在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)。并且，過表達(dá)miR-3619-5p可提高p21蛋白表達(dá)，抑制Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲，這說明過表達(dá)miR-3619-5p可抑制結(jié)腸癌進(jìn)展。

此外，本研究通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PFKFB3序列中含有與miR-3619-5p互補(bǔ)的位點(diǎn)，提示miR-3619-5p與PFKFB3之間可能是靶向結(jié)合關(guān)系。PFKFB3是糖酵解的重要調(diào)節(jié)因子，也是DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)的關(guān)鍵因子。PFKFB3在癌細(xì)胞中廣泛高表達(dá)，具有致癌性，與癌細(xì)胞增殖、血管侵襲、耐藥和腫瘤微環(huán)境有關(guān)[12]，已成為一種新的抗癌靶點(diǎn)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤異種移植模型中，抑制PFKFB3可增強(qiáng)癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[14]。PFKFB3在肝細(xì)胞癌[15]、肺腺癌[16]、乳腺癌[17]等惡性腫瘤中高表達(dá)，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、血管生成及耐藥性等。PFKFB3在結(jié)腸癌組織及結(jié)直腸腺癌組織中同樣高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、侵襲、轉(zhuǎn)移及患者生存期有關(guān)[6，18]。本研究發(fā)現(xiàn)，PFKFB3在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且抑制PFKFB3可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移和侵襲。PFKFB3可以被多種miRNA調(diào)控，如miR-449c通過靶向PFKFB3抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[19]，miR-488通過靶向PFKFB3抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和糖酵解[20]，miR-26b通過下調(diào)PFKFB3表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[21]。本研究雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)和Western blotting結(jié)果顯示，miR-3619-5p可靶向負(fù)調(diào)控PFKFB3的表達(dá)；通過同時(shí)過表達(dá)miR-3619-5p和PFKFB3的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PFKFB3可逆轉(zhuǎn)miR-3619-5p過表達(dá)抑制HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用，間接驗(yàn)證了在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中miR-3619-5p對PFKFB3有負(fù)調(diào)控關(guān)系。本研究中，患者樣本PFKFB3 mRNA與蛋白變化倍數(shù)一致，提示體內(nèi)PFKFB3的表達(dá)調(diào)控主要是以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主。miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)，但是患者樣本中PFKFB3在轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)變化，并與蛋白變化倍數(shù)一致，這無法排除miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控PFKFB3。因此，miR-3619-5p對PFKFB3的具體調(diào)控機(jī)制仍值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究顯示在結(jié)腸癌組織中miR-3619-5p下調(diào)，PFKFB3上調(diào)，miR-3619-5p可靶向PFKFB3抑制HCT116細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這表明miR-3619-5p和PFKFB3可能是結(jié)腸癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。