董鑫鵬，翟耘浩，陳廣潔

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其主要特征有持續(xù)性滑膜炎、全身性炎癥以及出現(xiàn)自身抗體(特別是RF和瓜氨酸化肽)[1]?？梢愿鶕?jù)是否存在抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)將RA分為2個(gè)亞型，其中ACPA陽性亞群比ACPA陰性亞群具有更強(qiáng)的臨床表型[2]。不受控制的活動(dòng)性RA將會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，甚至殘疾，還有可能引發(fā)心血管疾病和其它合并癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

外泌體是直徑40～100 nm的膜性囊泡，由磷脂雙分子層包裹，是細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)中的一個(gè)重要亞群，可以通過攜帶多種生物大分子對(duì)受體細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)特性及生理狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。早期由于人們對(duì)外泌體功能知之甚少，認(rèn)為外泌體是細(xì)胞外排廢棄物的一種形式，隨著近年來諸多外泌體相關(guān)研究的展開，外泌體的免疫調(diào)節(jié)功能也逐步被證實(shí)[4-5]。目前多項(xiàng)研究揭示外泌體在諸多生理病理過程中發(fā)揮重要的作用，并對(duì)RA發(fā)病過程中的免疫反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)RA患者中的自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的激活或抑制效果，因此，外泌體或可成為新型RA療法的突破性靶點(diǎn)，進(jìn)一步評(píng)估其潛在價(jià)值將對(duì)臨床上RA的實(shí)驗(yàn)性治療具有較大的意義。

1 外泌體

1.1 外泌體的定義、分布和成分外泌體是一種可由多種細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，通常被認(rèn)為是由胞內(nèi)的多泡體與細(xì)胞膜融合釋放到細(xì)胞外而產(chǎn)生的，可來源于體內(nèi)任何細(xì)胞，外泌體廣泛分布于血液、唾液、母乳、關(guān)節(jié)滑膜液等不同體液中。外泌體的脂雙層富含膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺，將內(nèi)部與外界隔離開，可顯著保護(hù)內(nèi)容物免于酶解。外泌體的主要成分蛋白質(zhì)來源于細(xì)胞非特異性蛋白分子和特異性蛋白分子兩類。前者為與來源細(xì)胞無關(guān)的共有蛋白，包括四跨膜蛋白超家族、熱休克蛋白、參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、細(xì)胞溶質(zhì)蛋白和外泌體酶等；后者為與來源細(xì)胞密切相關(guān)的一類特殊蛋白，可作為外泌體來源的鑒定指標(biāo)，如成年心肌細(xì)胞來源的外泌體含肌節(jié)蛋白，APC來源的外泌體含MHC和共刺激信號(hào)蛋白CD86等[3-5]。外泌體內(nèi)還含有豐富的RNA，如mRNA和包括miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在內(nèi)的非編碼RNA等[5]，其通過各種RNA在不同細(xì)胞間的傳播來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控。

1.2 外泌體的產(chǎn)生、作用機(jī)制和生物學(xué)功能

目前認(rèn)為，外泌體是由胞內(nèi)核體與高爾基體作用形成的多泡體(multivesicular body，MVB)通過質(zhì)膜出芽釋放或與膜泡融合釋放而形成?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)蛋白激酶D1/2通路在調(diào)控MVB的成熟和外泌體的釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)介導(dǎo)了二酰基甘油激酶α對(duì)MVB分泌的調(diào)控[6]。外泌體在被釋放后與內(nèi)環(huán)境中的可溶性因子結(jié)合，以旁分泌或內(nèi)分泌的方式被定向運(yùn)輸至靶細(xì)胞。外泌體通過直接被靶細(xì)胞內(nèi)吞攝取或靶細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2種方式作用于靶細(xì)胞。但外泌體作用于靶細(xì)胞的具體機(jī)制還不明確，有研究認(rèn)為，外泌體的攝取依賴于膽固醇和酪氨酸激酶活性，通過不依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用和大型胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞[7]。外泌體攜帶的物質(zhì)在自身免疫過程中可以成為自身抗原的來源，還能夠作為介導(dǎo)病原體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移或造成組織損傷的相關(guān)載體。

2 外泌體對(duì)RA發(fā)生、發(fā)展的影響

2.1 外泌體攜帶的蛋白質(zhì)介導(dǎo)RA發(fā)病大量存在于RA患者外泌體中的瓜氨酸化蛋白主要來源于由肽酰精氨酸脫亞氨家族酶催化的精氨酸的脫氨基作用，產(chǎn)物瓜氨酸化蛋白可作為抗原觸發(fā)自身免疫反應(yīng)，形成大量沉積于滑膜空間內(nèi)的免疫復(fù)合物(immune complex，IC)，進(jìn)而刺激肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生多種炎性因子，使RA病情進(jìn)一步惡化[8]；而巨噬細(xì)胞通過外泌體釋放的核DNA結(jié)合蛋白，也可作為自身抗原參與RA的發(fā)病過程[9]。RA患者體內(nèi)的滑膜液和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)分泌的外泌體中都被證實(shí)含有DNA結(jié)合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，Id1)。Id1可通過激活胞內(nèi)Jnk信號(hào)通路加速炎癥位置新血管的生成[10]，促進(jìn)FLS增殖，以及抑制免疫細(xì)胞IL-6和IL-8的分泌等多方面聯(lián)合作用于RA的發(fā)病[11]。Morgan等[12]在RA患者體內(nèi)血漿、滑膜液和FLS上清液中都分離出了帶有CD13的外泌體，隨后CD13被證實(shí)可大幅增強(qiáng)關(guān)節(jié)內(nèi)FLS的增殖和遷移能力，最終使FLS病理性增生；此外，CD13還可募集T細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織，分泌多種炎性因子促進(jìn)FLS增殖，使RA患者病情惡化。研究表明，F(xiàn)LS分泌的外泌體攜帶的膜型TNF-α可以激活PKB/AKT和NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)FLS分泌破壞細(xì)胞外骨和軟骨基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)以及阻斷胞內(nèi)細(xì)胞凋亡通路來抑制T細(xì)胞的正常凋亡[13-14]。

2.2 外泌體相關(guān)RNA介導(dǎo)RA發(fā)病外泌體內(nèi)的RNA所負(fù)責(zé)的基因調(diào)控功能主要依靠miRNA，其中的miR-155和miR-146a是近年來研究的熱點(diǎn)。相比正常人，ACPA陽性的RA患者的外周血樣本中IgD-CD27-的記憶B細(xì)胞內(nèi)的miR-155表達(dá)水平顯著升高，其結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子PU.1促進(jìn)BCR發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而促進(jìn)抗體生成，形成大量IC[15]；miR-155還會(huì)增強(qiáng)單核細(xì)胞招募外來免疫細(xì)胞，同時(shí)通過抑制滑膜組織內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)的表達(dá)來使其滯留于滑膜組織內(nèi)，加重局部炎癥[16]。RA患者體內(nèi)FLS中miR-155的表達(dá)明顯上調(diào)，與滑膜空間內(nèi)形成的慢性炎癥狀態(tài)密切相關(guān)；相同環(huán)境在IL-1β、TNF-α刺激下，表達(dá)上調(diào)的miR-146對(duì)IL-6、IL-8、IL-1受體相關(guān)激酶及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[17]。

miR-let-7b包含在巨噬細(xì)胞或FLS的EV中，滑膜細(xì)胞的死亡也可釋放大量miR-let-7b。miR-let-7b可通過結(jié)合幼稚單核細(xì)胞表面的TLR7來誘導(dǎo)其分化為M1型巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)TNF、IL-6等促炎因子的釋放，導(dǎo)致RA患者病情惡化。Kim等[18]測(cè)得RA滑膜液中miR-let-7b的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于骨關(guān)節(jié)炎滑膜液、RA患者血漿和正常人血漿，充分說明miR-let-7b是造成關(guān)節(jié)炎癥加重的關(guān)鍵因素。

除上述3種miRNA，其他的miRNA也會(huì)對(duì)RA發(fā)病產(chǎn)生作用。由TNF誘導(dǎo)的miR-211-3p表達(dá)上調(diào)可通過抑制Wnt信號(hào)通路中的Dkk2(Dickkopf2)來抑制成骨細(xì)胞的分化與鈣化，影響磨損區(qū)域的骨修復(fù)[19]。miR-17則可以靶向結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ類受體(transforming growth factor β receptor Ⅱ，TGFBR Ⅱ)來抑制Treg的分化，削弱自身免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用[20]。miR-124a、miR-19a在調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖和炎性因子的釋放過程中也有一定作用。

Song等[21]發(fā)現(xiàn)，除miRNA外，名為Hotair的反轉(zhuǎn)錄lncRNA大量存在于RA患者的血清外泌體和外周血單核細(xì)胞中，其過量表達(dá)可誘導(dǎo)活化后的巨噬細(xì)胞遷移至炎癥區(qū)域；Hotair還會(huì)通過活化MMP-2、MMP-13來加速骨和軟骨基質(zhì)的溶解，破壞溶骨成骨平衡，對(duì)關(guān)節(jié)造成不可逆的病理損傷。

2.3 不同細(xì)胞來源的外泌體對(duì)RA發(fā)病的影響已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞來源的外泌體可參與RA發(fā)病，但對(duì)于其所含的具體成分仍知之甚少，此部分將外泌體按照不同細(xì)胞來源進(jìn)行分類以進(jìn)一步描述其作用。

RA患者T細(xì)胞及單核細(xì)胞來源的外泌體可以刺激FLS分泌MMP-1、MMP-3、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、MCP-2等[22]；B細(xì)胞來源的外泌體主要負(fù)責(zé)自身抗原的遞呈，其中由B細(xì)胞分化而來的淋巴母細(xì)胞則可以分泌帶有MHC-Ⅱ和FasL的外泌體誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡，負(fù)調(diào)節(jié)病理性自身免疫反應(yīng)[23]；CD4+CD25+Foxp3+Treg來源的外泌體可以通過攜帶的miRNA沉默Th1的相關(guān)基因來削弱由Th1介導(dǎo)的自身免疫[24]；CD8+CD25+Foxp3+Treg來源的外泌體則能夠抑制自身殺傷性T細(xì)胞，延緩RA發(fā)病和病情進(jìn)一步惡化[25]；成熟DC分泌的外泌體可利用MHC分子和共刺激分子等向T細(xì)胞呈遞抗原，觸發(fā)自身免疫反應(yīng)[26]；未成熟DC來源的外泌體低表達(dá)共刺激分子，但通過自身高表達(dá)TGF-β、CD95L等免疫抑制性配體來抑制自身免疫反應(yīng)[27]；FLS來源的外泌體攜帶的TNF-α可以活化NF-κB信號(hào)通路，強(qiáng)化T細(xì)胞的抗凋亡能力，加強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[28]；血小板來源的外泌體也參與RA的炎癥發(fā)生過程，與RA活動(dòng)度密切相關(guān)[29]。

3 外泌體在RA臨床診療上的應(yīng)用

3.1 外泌體在RA臨床診斷上的應(yīng)用RA患者滑膜液和血清中的外泌體含有一系列與RA發(fā)病相關(guān)的蛋白，這類蛋白一半以上含有瓜氨酸殘基。這些瓜氨酸化蛋白主要以纖維蛋白原和波形蛋白等形式存在。在RA患者血清樣本中提取的外泌體內(nèi)檢測(cè)到淀粉樣蛋白A(amyloid A，AA)和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor1，LYVE-1)與CRP之間存在顯著正相關(guān)[30]，提示前兩者可能參與RA發(fā)病。

與正常人相比，RA患者血清中的外泌體含有7種表達(dá)水平明顯上調(diào)的lncRNA，分別是Hotair、LUST、anti-NOS2A、MEG9、SNHG4、TUG1及NEAT1；同時(shí)，另有6種相同來源的lncRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，分別是Malat1、SNHG1、mascRNA、PR antisense transcripts、PRINS及HOXA3as[21]。除lncRNA外，包括miR-155、miR-146、miR-let-7b在內(nèi)的多種miRNA在RA患者與正常人體內(nèi)也呈現(xiàn)差異表達(dá)。

基于外泌體攜帶的蛋白及RNA成分在RA患者體內(nèi)的異常表達(dá)，其可作為生物學(xué)標(biāo)志物提示RA發(fā)病。傳統(tǒng)的RA診斷主要根據(jù)滑膜液中的炎性標(biāo)志物、抗類風(fēng)濕性因子抗體以及抗CCP抗體等，但研究逐漸證實(shí)外泌體相關(guān)的多種成分也可以作為典型的RA診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。這類“新型”RA診斷標(biāo)志物主要有瓜氨酸化蛋白、AA蛋白、LYVE-1蛋白、包括Hotair在內(nèi)的多種lncRNA、miR-let-7b、miR-221-3p等，可以相對(duì)準(zhǔn)確地反應(yīng)疾病狀態(tài)。無論是作為RA生物標(biāo)志物進(jìn)行診斷，還是作為標(biāo)志物對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，外泌體相關(guān)成分都具有極大的臨床潛在價(jià)值。

3.2 外泌體在RA臨床實(shí)驗(yàn)性治療上的展望目前為止，所有關(guān)于外泌體療法的研究都還只停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，這類療法的臨床應(yīng)用尚未在人體開展。本文對(duì)利用外泌體實(shí)驗(yàn)性治療RA動(dòng)物模型的可能機(jī)制進(jìn)行了歸納(表1)。

表1 外泌體治療RA動(dòng)物模型(CIA小鼠)的可能機(jī)制

此外，還有文獻(xiàn)提到腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以對(duì)腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的增殖、活化起抑制作用，減弱相關(guān)免疫應(yīng)答，并且可以增強(qiáng)抗腫瘤疫苗的作用[31]；而DC來源的外泌體則可以作為抗腫瘤疫苗和生物工程外泌體用于體外和臨床前動(dòng)物研究[32]。這些研究都表明，外泌體在各類疾病微環(huán)境中都有著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作為一種重要的信息傳遞介質(zhì)能夠?qū)膊〉倪M(jìn)程產(chǎn)生多方面的影響。因此，利用外泌體的這一特性將其應(yīng)用于臨床前相關(guān)研究是一個(gè)有效的切入手段。

總體來說，外泌體療法是一種具有廣闊臨床應(yīng)用前景的新式療法。外泌體來源廣泛，在體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，脂溶性高，能夠跨越包括血腦屏障在內(nèi)的生物屏障，并且不會(huì)引起免疫排斥，其內(nèi)容物還可以免于酶的降解，有著較好的穩(wěn)定性，能直接靶向作用于局部特定細(xì)胞。但目前外泌體療法尚不成熟，自體外泌體的提取純化、高特異性回收等多方面效果仍不理想。

4 結(jié)語

目前來看，外泌體在RA發(fā)病中的研究主要集中在外泌體的產(chǎn)生及其作用機(jī)制、外泌體相關(guān)物質(zhì)在RA中的生物學(xué)功能和外泌體在RA診治中的潛在價(jià)值三方面。大量實(shí)驗(yàn)證明，外泌體在RA發(fā)病及診治的過程中有其獨(dú)特的優(yōu)越性，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在RA診療方面的嶄新突破口。外泌體作為標(biāo)志物對(duì)RA的早期診斷起到的警示作用將極大地改善患者的預(yù)后。但由于RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變、外泌體提純量化技術(shù)不夠完善、外泌體作用的具體機(jī)制尚不明朗，將外泌體廣泛地應(yīng)用于臨床仍然需要進(jìn)一步的研究。