張惠忠,張曉東,黃建新

張惠忠,張曉東,黃建新,金華廣福腫瘤醫(yī)院肝膽胰胃外科 浙江省金華市 321111

張惠忠,主治醫(yī)師,研究方向?yàn)楦文懸任竿饪?/p>

0 引言

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人們的生命健康.手術(shù)切除、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、靶向藥物治療的應(yīng)用雖然延長了肝癌患者的生存時(shí)間，但由于肝血供豐富，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是肝癌患者死亡的主要原因[1].紫杉醇是治療肝癌的常用化療藥物，然而在連續(xù)治療后肝癌細(xì)胞通常對紫杉醇脫敏，這嚴(yán)重限制其臨床療效[2].闡明肝癌進(jìn)展、紫杉醇耐藥的分子機(jī)制，對開發(fā)新的肝癌治療策略至關(guān)重要.環(huán)狀RNA（circRNA）是起源于外顯子、內(nèi)含子或基因間區(qū)域的閉環(huán)結(jié)構(gòu)RNA分子，其可能通過與特定微小RNA（miRNA）結(jié)合而扮演競爭性內(nèi)源RNA（ceRNAs）角色，從而調(diào)控下游基因表達(dá)，參與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等一系列生物學(xué)過程[3，4].研究報(bào)道circ_0000212在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增加，circ_0000212通過靶向miR-491和調(diào)節(jié)叉頭框蛋白4（FOXP4）表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[5].生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-139-5p是circ_0000212的潛在靶點(diǎn).miR-139-5p低表達(dá)被報(bào)道與肝癌患者預(yù)后差相關(guān)，上調(diào)miR-139-5p可抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解代謝、增殖和轉(zhuǎn)移[6].然而，circ_0000212是否靶向miR-139-5p參與癌癥進(jìn)展仍有待研究.本研究從細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和紫杉醇耐藥角度探討circ_0000212和miR-139-5p在肝癌進(jìn)展中的作用，旨在為抑制肝癌進(jìn)展、克服紫杉醇耐藥提供可用靶點(diǎn).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料:肝癌組織和對應(yīng)癌旁組織（正常組織）取自2018-05/2019-05在我院接受手術(shù)治療的41例肝癌患者.男性37例，女性4例，年齡在48-73歲之間，中位年齡57歲.切除后將組織快速冷凍，然后在-80 ℃下保存.

1.1.2 細(xì)胞和試劑:人肝癌細(xì)胞HCC9204購自美國ATCC;Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo fisher公司;SYBR Green mix試劑盒購自大連Takara公司;DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胎牛血清購自武漢普諾賽生物公司;紫杉醇（純度99.9%）購自上海研生生化試劑有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、si-circ_0000212、miR-139-5p inhibitor購自上海生工生物工程公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾維贊生物公司;Transwell小室購自美國Corning公司;山羊抗兔IgG二抗（ab205718）、兔cleaved-caspase3多克隆抗體（ab2302）兔磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（ab245355）購自美國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測肝癌組織中circ_0000212和miR-139-5p表達(dá):用Trizol試劑盒從組織中提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用SYBR Green mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR.反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min;然后94 ℃ 15 s和60 ℃1 min，循環(huán)40次.2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)水平.circ_0000212上游引物5′-GTT TGG GAG GCT TCT TGG TAA T-3′，circ_0000212下游引物5′-AAA GCC AGT TTC CTC CAA GC-3′;GAPDH上游引物5′-CAC CCA CTC CTC CAC CTT TG-3′，GAPDH下游引物5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3′;miR-139-5p上游引物5′-TCT ACA GTG CAC GTG TCT CCA G-3′，miR-139-5p下游引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′;U6上游引物5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′，U6下游引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):HCC-9204細(xì)胞接種到1%青鏈霉素雙抗+10%胎牛血清+89%DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱孵育.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞，1:2-1:3傳代.

1.2.3 紫杉醇濃度篩選:將對數(shù)期HCC-9204細(xì)胞按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板，分別用含1-40 nmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，向各孔內(nèi)添加10 μL CCK-8試劑，在37 ℃下繼續(xù)孵育2 h.酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的光密度（OD）值.存活率（%）=實(shí)驗(yàn)A/對照A×100%.選擇12 nmol/L紫杉醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組:將對數(shù)期HCC-9204細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種于96孔板，用Lipofectamine 2000分別將sicirc_0000212、si-circ_0000212+miR-139-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染融合度為50%HCC-9204細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)分組:未做任何處理的HCC-9204細(xì)胞記為對照組;轉(zhuǎn)染si-circ_0000212、轉(zhuǎn)染si-circ_0000212+miR-139-5p inhibitor的細(xì)胞分別記為干擾circ_0000212組、干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組;用含12 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)液孵育HCC-9204細(xì)胞，記為紫杉醇組;用含12 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-circ_0000212、轉(zhuǎn)染si-circ_0000212+miR-139-5p inhibitor的細(xì)胞，分別記為紫杉醇+干擾circ_0000212組、紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組.

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):含有野生型（WT）circ_0000212序列的熒光素酶報(bào)告載體WT-circ_0000212，或者含有突變型（MUT）circ_0000212序列的熒光素酶報(bào)告載體MUT-circ_0000212由上海生工公司提供.將WTcirc_0000212分別與miR-NC或miR-139-5p mimic共轉(zhuǎn)染到HCC9204細(xì)胞中;同時(shí)，將MUT-circ_0000212分別與miR-NC或miR-139-5p mimic共轉(zhuǎn)染到HCC9204細(xì)胞中.培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并使用雙熒光素酶檢測試劑盒測定相對熒光素酶活性.

1.2.6 CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖:CCK-8法:將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染si-circ_0000212細(xì)胞或轉(zhuǎn)染sicirc_0000212+miR-139-5p inhibitor細(xì)胞按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板，根據(jù)1.2.4實(shí)驗(yàn)分組分別給予紫杉醇（12 nmol/L）或不加藥物的含血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h.向各孔內(nèi)添加10 μL CCK-8試劑，在37 ℃下繼續(xù)孵育2 h.酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的OD值.抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)OD/對照OD）×100%

集落形成實(shí)驗(yàn):將各組HCC9204細(xì)胞按照5×102個(gè)/孔接種于6孔板，每2-3 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約2 w直到HCC9204細(xì)胞形成集落，用甲醇固定細(xì)胞集落，用0.1%結(jié)晶紫染色.在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù).

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲:每組取1×104個(gè)HCC9204細(xì)胞重懸在200 μL無血清培養(yǎng)基中，并接種在包被matrigel涂層的Transwell上室.同時(shí)，向24孔板下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基.培養(yǎng)48 h后，棉簽擦去未侵襲細(xì)胞，用4%聚甲醇固定膜下表面附著細(xì)胞，然后用0.1%結(jié)晶紫染色.顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，以平均值表示HCC9204細(xì)胞侵襲數(shù)量.遷移測定時(shí)選擇未包被matrigel涂層的Transwell上室，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)一致.

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:收集各組HCC9204細(xì)胞，2000 rpm離心5 min，PBS洗滌3次.用500 μL的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL annexin V/FITC和碘化丙啶（PI）.暗室孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀分析HCC9204細(xì)胞的凋亡情況.annexin V或PI染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)為凋亡細(xì)胞.

1.2.9 Western blot檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá):使用RIPA緩沖液裂解各組細(xì)胞，取約40 μg的提取蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，并濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜.用5%牛血清白蛋白阻斷PVDF膜，并與抗Cleaved-caspase3的一抗溶液4 ℃孵育12 h.隨后將PVDF至于辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗中室溫孵育1 h.將PVDF膜置于塑料薄膜上，滴加化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng).以Image J軟件測得的Cleaved-caspase 3和GAPDH條帶灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn).Pearson相關(guān)分析確定circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)在肝癌組織中的關(guān)系.P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 circ_0000212和miR-139-5p在肝癌組織中表達(dá)的分析 與癌旁組織比較，肝癌組織中circ_0000212表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-139-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖1A和圖1B.肝癌組織中circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.9928），見圖1C.

圖1 circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)的檢測及相關(guān)性分析.A:肝癌組織中circ_0000212高表達(dá);B:肝癌組織中miR-139-5p低表達(dá);C:circ_0000212和miR-139-5p負(fù)相關(guān).

2.2 紫杉醇對HCC9204中circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)的影響 用不同濃度的紫杉醇處理HCC9204細(xì)胞48 h，隨著紫杉醇濃度的增加HCC9204細(xì)胞存活率逐漸降低，紫杉醇對HCC9204細(xì)胞的IC50值為11.89 nmol/L.見圖2.用12 nmol/L的紫杉醇孵育HCC9204細(xì)胞，與對照組比較，紫杉醇組HCC9204細(xì)胞circ_0000212表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），miR-139-5p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3.

圖2 不同濃度紫杉醇對HCC9204細(xì)胞存活率的檢測.IC50=11.89 nmol/L.

圖3 紫杉醇對circ_0000212和miR-139-5p表達(dá)的檢測.與對照組相比,aP＜0.05.

2.3 circ_0000212和miR-139-5p靶向關(guān)系 Circular RNA interactome預(yù)測結(jié)果見圖4A，circ_0000212和miR-139-5p存在互補(bǔ)的核苷酸序列.miR-139-5p mimics和WTcirc_0000212共轉(zhuǎn)染組HCC9204細(xì)胞的相對熒光素酶活性與miR-NC和WT-circ_0000212共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低（P＜0.05）;miR-139-5p mimics和MUT-circ_0000212共轉(zhuǎn)染組HCC9204細(xì)胞的相對熒光素酶活性與miR-NC和MUTcirc_0000212共轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4B.干擾circ_0000212組HCC9204細(xì)胞miR-139-5p表達(dá)水平與對照組比較顯著升高（P＜0.05），見圖4C.

圖4 circ_0000212靶向調(diào)控miR-139-5p.A:circ_0000212和miR-139-5p的互補(bǔ)序列;B:雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn);C:circ_0000212調(diào)控miR-139-5p的表達(dá).

2.4 觀察轉(zhuǎn)染后紫杉醇對各組H C C9204增殖的影響 與對照組比較，干擾circ_0000212組、紫杉醇組HCC9204細(xì)胞抑制率顯著升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)顯著減少（P＜0.05）;與干擾circ_0000212組比較，干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞抑制率顯著降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)顯著增加（P＜0.05）;與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212組HCC9204細(xì)胞抑制率顯著升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)顯著減少（P＜0.05）;與紫杉醇+干擾circ_0000212組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞抑制率顯著降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)顯著增加（P＜0.05），見圖5和表1.

圖5 HCC9204克隆形成數(shù)的檢測.A:對照組;B:干擾circ_0000212組;C:干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組;D:紫杉醇;E:紫杉醇+干擾circ_0000212組;F:紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組.

表1 轉(zhuǎn)染后各組加入紫杉醇對HCC9204增殖的檢測（mean±SD,n=9）

2.5 觀察轉(zhuǎn)染后紫杉醇對各組HCC9204遷移侵襲的影響 與對照組比較，干擾circ_0000212組、紫杉醇組HCC9204細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05）;與干擾circ_0000212組比較，干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著增加（P＜0.05）;與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212組HCC9204細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05）;與紫杉醇+干擾circ_0000212組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著增加（P＜0.05），見圖6、圖7和表2.

圖6 HCC9204遷移細(xì)胞數(shù)的檢測.A:對照組;B:干擾circ_0000212組;C:干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組;D:紫杉醇;E:紫杉醇+干擾circ_0000212組;F:紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組.

圖7 HCC9204侵襲細(xì)胞數(shù)的檢測.A:對照組;B:干擾circ_0000212組;C:干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組;D:紫杉醇;E:紫杉醇+干擾circ_0000212組;F:紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組.

表2 轉(zhuǎn)染后各組加入紫杉醇對HCC9204遷移侵襲的檢測（mean±SD,n=9）

2.6 觀察轉(zhuǎn)染后紫杉醇對各組HCC9204凋亡的影響 與對照組比較，干擾circ_0000212組、紫杉醇組HCC9204細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;與干擾circ_0000212組比較，干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）;與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212組HCC9204細(xì)胞抑凋亡率、Cleavedcaspase3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;與紫杉醇+干擾circ_0000212組比較，紫杉醇+干擾circ_0000212 +miR-139-5p inhibitor組HCC9204細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖8、圖9和表3.

圖8 HCC9204凋亡率的檢測.A:對照組;B:干擾circ_0000212組;C:干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組;D:紫杉醇;E:紫杉醇+干擾circ_0000212組;F:紫杉醇+干擾circ_0000212+miR-139-5p inhibitor組.

圖9 Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的檢測.

表3 轉(zhuǎn)染后各組加入紫杉醇對HCC9204凋亡的檢測（mean±SD, n=9）

3 討論

circRNA已被報(bào)道參與肝癌進(jìn)展的各個(gè)方面，例如circ_100395表達(dá)水平與肝癌腫瘤分化、微血管浸潤和門靜脈腫瘤血栓形成有關(guān)，上調(diào)circ_100395表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），降低遷移和侵襲能力[7].circ_0091570低表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長[8].circ_0003418通過Wnt/β連環(huán)蛋白（β-catenin）通路抑制肝癌腫瘤發(fā)生和順鉑化療耐藥[9].circRNA桿狀病毒IAP重復(fù)序列蛋白6基因（circ-BIRC6）低表達(dá)介導(dǎo)紫杉醇對肝癌腫瘤發(fā)生的抑制作用[10].本研究發(fā)現(xiàn)circ_0000212在肝癌組織中的表達(dá)顯著升高，提示circ_0000212可能參與肝癌進(jìn)展.體外功能分析表明，干擾circ_0000212可抑制肝癌HCC9204細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，上調(diào)Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明circ_0000212在肝癌中發(fā)揮致癌作用.Wang等[11]報(bào)道circ_0000212可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡，在宮頸癌中起促腫瘤作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)類似.紫杉醇處理可抑制HCC9204細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，上調(diào)Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)circ_0000212表達(dá)水平，且干擾circ_0000212表達(dá)顯著增強(qiáng)紫杉醇對HCC9204細(xì)胞的抗增殖、抗遷移、抗侵襲和促凋亡作用，這提示干擾circ_0000212表達(dá)可提高HCC9204細(xì)胞對紫杉醇的敏感性.以上研究表明，干擾circ_0000212表達(dá)可能是抑制肝癌進(jìn)展、紫杉醇化療增敏的重要靶點(diǎn).

目前研究顯示circ_0000212在癌癥進(jìn)展中的作用均與調(diào)控miRNA表達(dá)有關(guān)[5，11].miR-139-5p為子宮內(nèi)膜癌[12]、乳腺癌[13]等多種腫瘤的抑制因子，研究報(bào)道m(xù)iR-139-5p低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床分期、病理分型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[14].過表達(dá)miR-139-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力，使腫瘤對化療敏感，抑制腫瘤體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移[15].在肝癌中miR-139-5p對癌細(xì)胞活力、侵襲均有抑制作用，并抑制肝癌EMT和轉(zhuǎn)移[16，17].本研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在肝癌組織表達(dá)下調(diào)，且肝癌組織中miR-139-5p和circ_0000212表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.此外，紫杉醇處理顯著上調(diào)miR-139-5p表達(dá)水平.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)miR-139-5p是circ_0000212的特異性靶點(diǎn)，這提示circ_0000212可能靶向miR-139-5p調(diào)控肝癌進(jìn)展和紫杉醇敏感性.深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-139-5p表達(dá)顯著減弱干擾circ_0000212表達(dá)對HCC9204細(xì)胞惡性生物行為的抑制作用，且減弱干擾circ_0000212表達(dá)聯(lián)合紫杉醇處理對HCC9204細(xì)胞惡性生物行為的抑制作用，這進(jìn)一步證實(shí)circ_0000212靶向miR-139-5p調(diào)控肝癌進(jìn)展和紫杉醇敏感性.

4 結(jié)論

綜上所述，circ_0000212在肝癌組織中表達(dá)增加，干擾circ_0000212通過靶向上調(diào)miR-139-5p表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移和侵襲能力，并提高其對紫杉醇的敏感性.這些發(fā)現(xiàn)表明，circ_0000212和miR-139-5p可能是紫杉醇化療增敏、抑制肝癌進(jìn)展的潛在靶點(diǎn).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

手術(shù)切除、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、靶向藥物治療的應(yīng)用雖然延長了肝癌患者的生存時(shí)間，但由于肝血供豐富，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是肝癌患者死亡的主要原因.紫杉醇是治療肝癌的常用化療藥物，然而在連續(xù)治療后肝癌細(xì)胞通常對紫杉醇脫敏，這嚴(yán)重限制其臨床療效.circRNA作為非編碼RNA，其可吸附miRNA參與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等一系列生物學(xué)過程.因此，亟需尋找新型circRNA作為肝癌的治療靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

circ_0000212在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，并可作為癌基因參與結(jié)直腸癌進(jìn)展，但circ_0000212在肝癌中的表達(dá)方式和作用尚不清楚.靶基因預(yù)測顯示miR-139-5p與circ_0000212存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-139-5p在肝癌中表達(dá)降低，上調(diào)miR-139-5p可抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解代謝、增殖和轉(zhuǎn)移，因此本研究主要探索circ_0000212靶向miR-513b-5p在肝癌進(jìn)展中的作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

驗(yàn)證circ_0000212在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用，circ_0000212通過靶向調(diào)控miR-139-5p從而調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性行為和紫杉醇敏感性.

實(shí)驗(yàn)方法

采用RT-qPCR檢測circ_0000212和miR-139-5p在肝癌組織、癌旁組織中的表達(dá).雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circ_0000212和miR-139-5p靶向關(guān)系.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率;集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲數(shù).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

肝癌組織中circ_0000212表達(dá)上調(diào)，miR-139-5p表達(dá)下調(diào).circ_0000212可靶向負(fù)調(diào)控miR-139-5p表達(dá).干擾circ_0000212可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高其對紫杉醇的敏感性.circ_0000212靶向負(fù)調(diào)控miR-139-5p表達(dá).抑制miR-139-5p表達(dá)顯著減弱干擾circ_0000212表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡以及紫杉醇敏感性的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

干擾circ_0000212通過靶向上調(diào)miR-139-5p可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高其對紫杉醇的敏感性.

展望前景

circ_0000212和miR-139-5p可能是紫杉醇化療增敏、抑制肝癌進(jìn)展的潛在靶點(diǎn).