鄒繼華， 張 維， 沈 敏， 張 曼， 屠敏敏， 王惠民， 周厚清

（1. 美康生物參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038；3. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226019；4. 深圳市心血管病研究所臨床研究與流行病學(xué)室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 100037）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是循環(huán)系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱，主要包括心臟、動脈、靜脈、毛細(xì)管等部位的疾病，一般與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。全球每年大約有1 790萬人死于CVD，占全世界死亡人數(shù)的31%，85%的CVD死亡事件由心臟病和卒中引起[1]。

《中國心血管病報(bào)告2018》[2]中指出，我國CVD患病率及死亡率仍處于上升階段，并居各種疾病死亡率的首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。因此，對CVD高危人群進(jìn)行干預(yù)可降低CVD發(fā)生率。血脂異常是CVD的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一。據(jù)2002中國健康與營養(yǎng)調(diào)查（China Health and Nutrition Survey，CHNS）[3]、中國慢性腎病工作組調(diào)查[4]、2011 CHNS[5]及《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015年）》[6]顯示，2002—2012年，我國成人血脂異常率從18.60%上升至40.40%。因此，開展血脂檢查及測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化對于全面防治CVD意義重大。

血液中的脂類基本上會與蛋白質(zhì)結(jié)合成為脂蛋白。一般將血清脂蛋白分為低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、中間密度脂蛋白（intermediate-density lipoprotein，IDL）、極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL）和乳糜微粒（chylomicron，CM）。美國膽固醇教育計(jì)劃將血清低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量作為CVD主要的治療效果評價(jià)指標(biāo)之一。有研究發(fā)現(xiàn)，HDL和LDL亞組分具有不同的臨床意義[7-8]。因此，如何提高脂蛋白亞組分的分離技術(shù)及測量方法的標(biāo)準(zhǔn)化也顯得非常重要。脂蛋白（a）[lipoprotein（a），Lp（a）]是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其蛋白與脂質(zhì)結(jié)合的特殊性使其在人群中分布的異質(zhì)性很大，且具有遺傳傾向。通過分析各脂蛋白亞組分和Lp（a），并結(jié)合傳統(tǒng)的血脂檢測，可更精準(zhǔn)地評估CVD風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測CVD的發(fā)生概率，有利于及早干預(yù)，降低CVD的患病率及死亡率。

1 LDL亞組分

LDL亞組分主要是依據(jù)顆粒粒徑、密度以及阻滯系數(shù)進(jìn)行分型。

1.1 根據(jù)顆粒粒徑進(jìn)行LDL分型

根據(jù)顆粒粒徑進(jìn)行分型的分離技術(shù)主要有凝膠電泳（gel electrophoresis，GE）、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）法和離子淌度（ion mobility，IM）法。HOEFNER等[9]通過采用NMR法測定顆粒粒徑對LDL進(jìn)行分類，共分出3種不同類型的LDL亞組分，A類粒徑為20.6～22.0 nm，中間類型粒徑為20.4～20.5 nm，B類粒徑為19.0～20.3 nm。DAVY等[10]將同一血漿樣本分別送往2家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，其中1家實(shí)驗(yàn)室采用GE法將LDL分為3類，A類粒徑為26.30～28.50 nm，AB類粒徑為25.75～26.34 nm，B類粒徑為<25.74 nm；另1家實(shí)驗(yàn)室采用NMR法將LDL分為2類，A類粒徑為20.6～22.0 nm，B類粒徑為≤20.5 nm。梯度凝膠電泳（gradient gel electrophoresis，GGE）檢測的LDL顆粒大小與NMR法平均相差5.38 nm（NMR法測出的顆粒較小），但是該差值在實(shí)踐中無法統(tǒng)一應(yīng)用，因?yàn)殡S著LDL粒徑的增加，該差值會變得更大。從臨床角度來看，觀察到B類的一致性是中等的，這意味著在重要亞組分的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)評估中，GGE和NMR法不可互換，需要與前瞻性研究進(jìn)行比較，以確定哪種方法在心血管風(fēng)險(xiǎn)評估中更好，但迄今為止尚未見此類報(bào)道。HIRANY等[11]通過聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳參考方法（polyacrylamide gradient gel electrophoresis reference method，PGGE-REF）將LDL分為3類：小粒徑為>25.8 nm，中粒徑為25.8～26.3 nm，大粒徑為>26.3 nm。CAULFIELD等[12]用超速離心結(jié)合IM法得到4種LDL亞組分，分別為LDL-Ⅰ、LDL-Ⅱ、LDL-Ⅲ和LDL-Ⅳ，其粒徑分別為21.99～23.80、21.10～21.99、20.17～21.10和18.00～20.17 nm。KRAUSS等[13]采用IM法將LDL分為7種亞組分，LDL1的粒徑為22.46～23.32 nm，LDL2a的粒徑為22.20～22.45 nm，LDL2b的粒徑為21.41～22.19 nm，LDL3a的粒徑為20.82～21.40 nm，LDL3b的粒徑為20.49～20.81 nm，LDL4a的粒徑為19.90～20.48 nm，LDL4b的粒徑為19.00～19.89 nm。NMR法直接測定LDL顆粒數(shù)，GE法測定的是載脂蛋白B（apolipoprotein B，apo B）含量。由于每個(gè)LDL均帶有apo B，因此雖然apo B含量和LDL顆粒數(shù)2個(gè)變量并不相同，但相互之間有一定的關(guān)聯(lián)。另外，VLDL和IDL也攜帶著apo B。有研究結(jié)果顯示，對于同一批的27個(gè)樣本，采用GE法根據(jù)apo B濃度（>1 200 mg/L）可確定6例樣本處于高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)，而采用NMR法，根據(jù)LDL顆粒數(shù)（1 300～1 599 nmol/L）可確定20例樣本處于高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)[10]，因此使用LDL顆粒數(shù)這一參數(shù)可以識別更多的高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，有利于臨床進(jìn)行干預(yù)。由此可見，使用LDL顆粒數(shù)來評估CVD風(fēng)險(xiǎn)更為可靠。

1.2 根據(jù)顆粒密度進(jìn)行LDL分型

根據(jù)顆粒密度進(jìn)行LDL分型的分離技術(shù)主要是超速離心法。DAVIES等[14]用碘克沙醇作為密度液，通過密度梯度超速離心（density gradient ultracentrifugation，DGUC）將LDL分為4類，分別為LDL-Ⅰ、LDL-Ⅱ、LDL-Ⅲ和LDL-Ⅳ，密度依次是1.022～1.025、1.025～1.028、1.028～1.036和>1.036 kg/L。GEISS等[15]采用DGUC將LDL分為7種亞型，LDL-1和LDL-2為大而輕低密度脂蛋白（large buoyant low-density lipoprotein，lb-LDL），LDL-3和LDL-4為中間密度LDL，LDL-5、LDL-6和LDL-7為小而密低密度脂蛋白（small and dense low-density lipoprotein，sd-LDL），并證實(shí)sd-LDL的密度為1.044～1.060 kg/L。WILLIAMS等[16]采用垂直梯度離心（vertical auto profile，VAP）得到4種LDL亞組分（LDL-1～LDL-4）。盡管各個(gè)文獻(xiàn)中LDL亞組分的種類有多有少，但總體上，根據(jù)顆粒密度LDL可分為3種：lb-LDL（1.020～1.025 kg/L）、中間密度LDL（1.030～1.040 kg/L）和sd-LDL（1.041～1.066 kg/L）。

1.3 根據(jù)顆粒阻滯系數(shù)（retardation factor，Rf）進(jìn)行LDL分型

Rf是LDL亞組分譜帶相對于VLDL譜帶和HDL譜帶的移動距離之比，計(jì)算公式為：Rf=VLDL與LDL亞組分之間的距離/VLDL與HDL之間的距離。HIRANY等[11]采用管狀聚丙烯酰胺凝膠電泳使LDL亞組分譜帶在VLDL和HDL譜帶之間遷移，將VLDL帶（遷移最慢）的Rf值標(biāo)記為0，HDL帶（遷移最快）的Rf值標(biāo)記為1，根據(jù)Rf值將LDL分為大LDL、中LDL和小LDL，Rf值分別為<0.38、0.38～0.40和>0.40。HOEFNER等[9]使用平均Rf值，通過軟件計(jì)算LDL亞組分分?jǐn)?shù)（low-density lipoprotein subfraction score，LDLSF），根據(jù)LDLSF將LDL分為3類，A類LDL<5.5，B類LDL>8.5，中間類型LDL為5.5～8.5。

2 HDL亞組分

HDL亞組分主要依據(jù)顆粒粒徑和密度進(jìn)行分型。

2.1 根據(jù)顆粒粒徑的HDL分型

通過GGE可將HDL按粒徑分為HDL2b（12.9～9.8 nm）、HDL2a（9.7～8.9 nm）、HDL3a（8.8～8.3 nm）、HDL3b（8.2～7.9 nm）和HDL3c（7.8～7.2 nm）。通過二維凝膠電泳可將HDL分為α-1（11.2～10.8 nm）、α-2（9.4～9.0 nm）、α-3（8.5～7.6 nm）、α-4（7.5～7.0 nm）和Pre-β-1（6.0～5.0 nm）。通過NMR檢測出的HDL分類與GGE分類方法相同，都可根據(jù)粒徑大小分為5類，分別為HDL-1～HDL-5，與GGE分離的5類HDL密切相關(guān)。采用IM法可將HDL分為2類，分別是HDL2b（14.5～10.6 nm）和HDL2a+3（10.5～7.65 nm）。

2.2 根據(jù)顆粒密度的HDL分型

采用DGUC可將HDL按密度不同分為HDL2b（1.063～1.087 g/mL）、HDL2a（1.088～1.109 g/mL）、HDL3a（1.110～1.128 g/mL）、HDL3b（1.129～1.153 g/mL）和HDL3c（1.154～1.170 g/mL）。除此之外，正常人血漿中HDL還可分為HDL2（1.063～1.124 g/mL）和HDL3（1.125～1.210 g/mL），HDL1僅存在于高膽固醇膳食誘導(dǎo)后[17]。

3 LDL與HDL亞組分的分離技術(shù)

3.1 沉淀法

1984年，LUNDBERG等[18]提出利用硫酸葡聚糖和聚乙二醇6000等作為沉淀劑，通過調(diào)節(jié)溶液濃度和pH值，將HDL2和HDL3進(jìn)行分離，該法方便、省力、無需專門設(shè)備。但沉淀法會受高水平三酰甘油（triglyceride，TG）的影響，apo B顆粒不能完全被沉淀，影響了分離效果，因此沉淀法已逐漸被淘汰。

3.2 均相檢測法

ITO等[19]建立了快速、有效、全自動的HDL3-C測定方法。（1）第1步。鞘磷脂酶優(yōu)先與富三酰甘油脂蛋白（triglyceride-rich lipoprotein，TRL）和LDL反應(yīng)，并分解它們。這些脂蛋白釋放的膽固醇通過膽固醇酯酶/氧化酶生成過氧化氫。過氧化氫酶將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，因沒有生色源，所以產(chǎn)生非生色產(chǎn)物。（2）第2步。聚氧乙烯苯乙烯化的苯醚衍生物與HDL3選擇性地反應(yīng)，然后將HDL3-C作為標(biāo)準(zhǔn)過氧化物酶系統(tǒng)中的顯色物進(jìn)行測定。反應(yīng)混合物中的過氧化氫酶被疊氮化鈉抑制?？侶DL-C用均相法測定，通過總HDL-C與測得的HDL3-C的差值來估算HDL2-C。該法與超速離心法測得的HDL3-C和HDL2-C結(jié)果有極好的相關(guān)性（r2值分別為0.848和0.982）。均相檢測法由于測定快速，一般只應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測。另外，由于不同均相檢測法試劑的變異度較大，因此準(zhǔn)確性不足。

3.3 超速離心法

DGUC是根據(jù)HDL和LDL顆粒浮力密度的不同，經(jīng)不同密度梯度氯化鈉溶液超速離心后，將HDL和LDL各亞組分依次轉(zhuǎn)移至各密度區(qū)域。DGUC可根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整密度梯度，從而得到不同的亞組分。連續(xù)的DGUC可同時(shí)將脂蛋白各組分及亞組分分離，是分離HDL和LDL亞組分的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但所需樣本量較大，分離時(shí)間長，成本較高，并且由于Lp（a）密度和sd-LDL密度存在交叉區(qū)，該法分離得到的LDL亞組分?；煊蠰p（a）。DONG等[20]在密度>1.044 g/mL的分離溶液中加入巰基乙醇，成功消除了Lp（a）的影響，從而實(shí)現(xiàn)了超速離心法對HDL亞組分、LDL亞組分及Lp（a）的分離。

3.4 VAP

VAP是利用垂直轉(zhuǎn)頭密度梯度離心脂蛋白，經(jīng)VAP-Ⅱ在線膽固醇檢測儀（簡稱VAP-Ⅱ）檢測后，繪制出LDL亞組分的分布曲線，然后根據(jù)各曲線積分面積比例計(jì)算亞組分水平。VAP-Ⅱ使用窄口聚四氟乙烯線圈作為反應(yīng)器，代替了上一代VAP儀器中的Technicon自動分析儀，避免了因氣泡導(dǎo)致的分析物流分段。與耗時(shí)10 h的傳統(tǒng)超速離心法相比，VAP將離心時(shí)間縮短至1 h。VAP使用的是一個(gè)垂直轉(zhuǎn)子，其中脂蛋白在離心管較短的水平軸上分離，且分辨率較高。WILLIAMS等[16]采用VAP-Ⅱ得到4種LDL亞組分（LDL-1～LDL-4），LDL亞組分中的sd-LDL與CVD的相關(guān)性最強(qiáng)，并且獨(dú)立于傳統(tǒng)血脂指標(biāo)。

VAP血脂分型在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室血脂項(xiàng)目的基礎(chǔ)上增加了特殊內(nèi)容，臨床操作性更強(qiáng)、耗時(shí)更少、信息更豐富，避免了多次檢測帶來的成本浪費(fèi)和時(shí)間壓力。目前，我國關(guān)于VAP的血脂檢測結(jié)果在CVD中的應(yīng)用的研究較少，其分區(qū)、分型和計(jì)算是否能真實(shí)反映該地區(qū)人群血脂紊亂的類型和狀態(tài)仍需進(jìn)一步研究。VAP的臨床應(yīng)用價(jià)值和分析體系還需要多地區(qū)、多中心的研究數(shù)據(jù)來支撐。另外，脂蛋白亞組分測量參考系統(tǒng)也急需建立，以進(jìn)一步提高VAP檢測的準(zhǔn)確度。

3.5 GE法

3.5.1 GGE GGE是一種操作簡單的測定HDL和LDL亞組分的方法。利用分子篩和電荷效應(yīng)分離HDL和LDL亞組分，并根據(jù)所占總?cè)旧娣e的比例計(jì)算出各組分水平，只需微量血清就能檢測，且可同時(shí)檢測多個(gè)樣本，但分離時(shí)間超過24 h，且特異性較差，無法對HDL和LDL亞組分進(jìn)行定量分析。AUSTIN等[21]用2%～16%的聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳將LDL分為A型和B型，而WILLIAMS等[16]用2%～14%的聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳得到7種LDL亞組分。此外，Berkeley Heartlab分段梯度凝膠電泳系統(tǒng)（LDLS3GGE）也可將LDL分離為7種亞組分。

3.5.2 管狀凝膠電泳法（tube gel electrophoresis，TGE） 美國Quantimetrix公司研發(fā)的Lipoprint脂蛋白分析系統(tǒng)采用高分辨率的3%聚丙烯酰胺凝膠管，可將LDL分為7種亞組分。其原理是將25 μL樣本與200 μL液體加載凝膠（含蘇丹黑B染料，用于脂蛋白染色）混合，將所得混合物添加到預(yù)制的3%聚丙烯酰胺凝膠管的頂部，在室溫下光聚合30 min后，將樣本電泳1 h（每凝膠管3 mA）。電泳后，在進(jìn)行光密度測定之前，將試管在黑暗環(huán)境中靜置1 h。添加黑暗環(huán)境孵育的作用是增加條帶在掃描前的均勻性。使用Helena EDC系統(tǒng)（美國Helena Laboratories公司）在610 nm處進(jìn)行光密度測定。Helena EDC系統(tǒng)添加了12管固定裝置，可在掃描過程中固定凝膠管，顯著提高了凝膠管掃描的一致性。使用配套的軟件分析Helena EDC系統(tǒng)的原始數(shù)據(jù)和不同LDL亞組分的電泳掃描圖樣，以計(jì)算LDL分級分?jǐn)?shù)并指定表型（A型、B型或中間型）。Lipoprint系統(tǒng)已通過了美國食品與藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證，可用于LDL臨床檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

3.6 毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）

3.6.1 毛細(xì)管等速電泳（capillary isokinetic electrophoresis，CITP） CITP是采用不連續(xù)介質(zhì)的電泳技術(shù)，即緩沖液由前導(dǎo)電解質(zhì)（leading electrolyte，LE）和終末電解質(zhì)（terminating electrolyte，TE）組成，樣本成分的遷移率介于LE和TE之間，達(dá)到平衡后各組分遷移速度與LE相同。CITP的特點(diǎn)是具有濃縮效應(yīng)，可與其他模式聯(lián)用，以達(dá)到柱上濃縮的目的。MORENO-GORDALIZA等[22]建立的分離LDL亞組分的CITP，可在pH值為8.8～9.4的梯度下，在9.5 min內(nèi)完成分析，得到6個(gè)LDL亞組分峰。有研究結(jié)果顯示，CITP可在7 min內(nèi)將脂蛋白分成9條區(qū)帶，其中HDL被分成3個(gè)亞類[快速遷移帶，被稱為α-HDL，主要含載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，apo A1）和磷脂酰膽堿；中間遷移帶，富含膽固醇，蛋白質(zhì)成分為載脂蛋白A2（apolipoprotein A2，apo A2）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，apo E）和載脂蛋白C（apolipoprotein C，apo C）；慢速遷移帶，被稱為pre-β-HDL，含apo A1和載脂蛋白A4（apolipoprotein A4，apo A4）][23]。該法目前尚處于研究階段，還未商品化。

3.6.2 微流控芯片電泳（microfluidics electrophoresis，ME） ME是在傳統(tǒng)CE的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。該方法可在石英、玻璃、塑料等材質(zhì)的基片上刻蝕微管道網(wǎng)絡(luò)，在一塊幾平方厘米的基片上完成電泳分離。ME可方便地進(jìn)行小體積（nL）進(jìn)樣、分離等操作，實(shí)現(xiàn)快速、高效分離。2002年，WEILLER等[24]首次采用ME分析血清脂蛋白，但LDL和HDL未實(shí)現(xiàn)基線分離，重復(fù)性較差。2005年，PING等[25]利用聚甲基丙烯酸甲酯微芯片分析HDL標(biāo)準(zhǔn)品，HDL2和HDL3被初步分離；錢晶晶等[26]采用十二烷基硫酸鈉同時(shí)修飾HDL和微管道，可在4 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)血清HDL2和HDL3的基線分離。他們同時(shí)對多例臨床樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)健康體檢者和CHD患者的HDL2區(qū)帶有明顯差異。WANG等[27]在刻蝕有微泳道的小型基片上實(shí)現(xiàn)了LDL亞組分的分離檢測，在該檢測系統(tǒng)上向樣本中添加直徑為5 nm、濃度為80 nmol/L的納米金可明顯提高LDL亞組分的分辨率。

3.7 NMR

NMR根據(jù)HDL和LDL顆粒內(nèi)核和外殼中脂類甲基團(tuán)的質(zhì)子磁共振信號檢測顆粒大小，利用甲基團(tuán)的不同信號區(qū)分各亞組分，以NMR甲基團(tuán)振幅測定亞組分濃度。MATYUS等[28]采用NMR對LDL顆粒數(shù)目進(jìn)行檢測，得到3種亞組分，批內(nèi)、批間精密度為2.6%～5.8%，滿足臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測要求。MCGARRAH等[29]采用NMR將HDL根據(jù)顆粒直徑分為大HDL（9.4～14.0 nm）、中HDL（8.2～9.4 nm）和小HDL（7.3～8.2 nm）三大類，并通過計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比評估出高密度脂蛋白顆粒（highdensity lipoprotein particle，HDL-P）濃度與CVD死亡率密切相關(guān)，因此可將HDL-P納入全球急性冠狀動脈綜合征注冊（the Global Registry of Acute Coronary Events，GRACE）風(fēng)險(xiǎn)評分中來提高風(fēng)險(xiǎn)識別。但該法使用儀器——核磁共振儀極其昂貴，且需專人使用并進(jìn)行圖譜分析，檢測成本很高，尚無法在臨床推廣。

3.8 IM法

IM法的原理是使用電噴射產(chǎn)生氣溶膠單電荷大粒子，然后經(jīng)過不同的流動分析單元在大氣壓下根據(jù)IM的不同進(jìn)行分離，隨后冷凝聚集各粒子，最后進(jìn)行激光散射掃描檢測。經(jīng)過超速離心去除白蛋白的步驟后，根據(jù)IM確定血清樣本中脂蛋白顆粒的大小和濃度。掃描時(shí)間為2 min，覆蓋的范圍為17.2～540.0 ?。掃描后，通過在與特定脂蛋白亞類相對應(yīng)的預(yù)定大小范圍內(nèi)的總顆粒數(shù)來合并數(shù)據(jù)。IM法得出的LDL顆粒濃度與超速離心法得出的LDL-C和apo B結(jié)果呈正相關(guān)（r值分別為0.90、0.79，P<0.05）。

3.9 高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）

HPLC可與超速離心法結(jié)合，用于HDL或LDL亞組分的分離和檢測[20]。檢測步驟：取5份血清，其中2份血清與含有脯氨酸的溴化鈉溶液混合，使背景密度為1.006和1.044 kg/L；另外3份血清與含脯氨酸和巰基乙醇的溴化鈉溶液混合，使背景密度為1.044、1.063和1.125 kg/L，超速離心后，用HPLC測定超速離心底部各種組分的膽固醇。巰基乙醇可使Lp（a）解離，解離前后Lp（a）存在明顯的密度分界點(diǎn)（1.044 kg/L），從而使脂蛋白亞組分和脂蛋白（a）膽固醇[lipoprotein（a） cholesterol，Lp（a）-C]測定成為可能。HPLC結(jié)合超速離心法已成功用于高脂血癥患者血漿脂蛋白的分析，且顯示出比連續(xù)超速離心法更高的準(zhǔn)確性。

3.10 陰離子交換色譜法

HIROWATARI等[30]成功建立了一種準(zhǔn)確、方便的脂蛋白亞組分分離檢測方法。該方法將血清注入陰離子交換色譜柱，通過不同高氯酸根離子濃度梯度洗脫分離出2類HDL亞組分，分別為HDL2和HDL3；之后將含有脂蛋白亞組分的洗脫液與酶試劑混合，并在37 ℃下反應(yīng)2.1 min，最后在600 nm波長下進(jìn)行檢測。

3.11 動態(tài)光散射（light-scattering，LS）法

LS法使用的技術(shù)是光子相關(guān)光譜，用2種乳膠粒子溶液作為標(biāo)準(zhǔn)，由于顆粒受到周圍液體分子的撞擊做布朗運(yùn)動，觀察到的散射光強(qiáng)度將不斷地隨時(shí)間起伏漲落，以散射光的波動強(qiáng)度來檢測脂蛋白亞組分[31]。LS法不會受到凝膠梯度和質(zhì)量不一致的影響，可在30 min內(nèi)確定樣本中LDL的峰值粒徑，具有實(shí)現(xiàn)自動化檢測的潛力。雖然不同的脂蛋白類別需要具有不同梯度的凝膠，但是基于LS原理的儀器理論上可測定各種脂蛋白顆粒的大小。然而，使用LS法檢測脂蛋白顆粒時(shí)，樣本的制備至關(guān)重要，任何污染的顆粒或聚集體都會影響檢測結(jié)果。因此，該方法需與超速離心法結(jié)合使用，并通過過濾器過濾掉粉塵等顆粒物質(zhì)。

4 Lp（a）的組成及分離檢測

Lp（a）核心部分由TG、磷脂、膽固醇、膽固醇酯等脂質(zhì)和2種載脂蛋白組成，結(jié)構(gòu)類似LDL，含有LDL中沒有的載脂蛋白（a）[apolipoprotein（a），apo（a）]。apo（a）與纖溶酶原具有高度同源性，在纖溶系統(tǒng)多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，從而影響動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展。Lp（a）含有2類載脂蛋白，即apo B100和apo（a），二者通過1～2個(gè)二硫鍵共價(jià)相連。用還原劑巰基乙醇處理Lp（a）時(shí)，apo（a）可從Lp（a）分子上脫落下來，成為不含脂質(zhì)的一類糖蛋白。剩下僅含apo B100的顆粒，被稱為Lp（a-）。

4.1 Lp（a）的分離檢測方法

4.1.1 Lp（a）純品的分離制備 （1）超速離心法。許平等[32-34]采用超速離心法，根據(jù)Lp（a）的密度將Lp（a）分離出來，再經(jīng)柱層析制備出Lp（a）。然而，此法有2個(gè)缺點(diǎn)：一是超速離心時(shí)間長，費(fèi)用高；二是離心時(shí)密度范圍窄，凝膠柱層析回收率低，這就導(dǎo)致Lp（a）的得率很低，一般只有15%～20%。因此，張文武等[35]利用免疫親和層析高特異性和高回收率的特點(diǎn)，建立了一種短時(shí)間超速離心結(jié)合免疫親和層析分離Lp（a）的方法，成功地分離了幾批Lp（a），純度和得率均優(yōu)于國外常規(guī)方法，并已用于基礎(chǔ)研究和臨床研究。劉忠民等[36]先用多價(jià)陰離子化合物磷鎢酸-Mg2+沉淀包括Lp（a）在內(nèi)的全部含apo B的脂蛋白，然后經(jīng)超速離心和Sepharose 6B柱、抗apo（a） IgGSepharose 4B免疫親和柱層析，得到Lp（a）、LDL和VLDL純品。林春榕等[37]使用固體溴化鉀將血漿密度調(diào)至1.055和1.120 g/mL，即得到密度為1.055～1.120 g/mL的富含Lp（a）的脂蛋白液。將該脂蛋白液使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.4，含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、0.01% NaN3）徹底透析，最后使用30%聚乙二醇20000濃縮至6 mL左右。高玉敏等[38]分析了幾種用于分離Lp（a）的方法，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)方法都需要超速離心這一步驟，超速離心需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和大量的時(shí)間，樣本處理量有限，而且分離出來的Lp（a）只是在1個(gè)限定密度內(nèi)的Lp（a）。但考慮到游離的apo（a），Lp（a）的實(shí)際漂浮密度無法明確范圍，可以低于1.006 g/mL，也可以高于1.120 g/mL，所以經(jīng)過超速離心，Lp（a）損耗較大，超速離心后一般還需要去除HDL和LDL，因此得率更低。（2）親和層析法。常用的親和層析主要有賴氨酸-瓊脂糖凝膠柱親和層析，但是用賴氨酸類似物洗脫時(shí)，往往會同時(shí)洗脫下來纖溶酶原，還需要更復(fù)雜的方法去除纖溶酶原。商品化的Lp（a）純品一般在超速離心分離后經(jīng)Lp（a）單抗親和層析純化，價(jià)格昂貴。針對此現(xiàn)象，高玉敏等[38]建立了一種經(jīng)一系列層析柱（LIPOSORBER LA15柱、SephacryS-400HR分子篩和離子交換柱）批量分離純化Lp（a）的方法，采用上述3種柱層析后，Lp（a）的純度較好[纖溶酶原含量僅占Lp（a）的0.03%]，但得率不高，分離的Lp（a）總得率僅為27%，從100 mL血液中僅能分離出1.5 mg Lp（a）。

4.1.2 Lp（a）的檢測方法 Lp（a）濃度大部分是通過免疫化學(xué)方法檢測其apo（a）部分得出的。選擇一種合適的Lp（a）免疫測定法的困難之處在于apo（a）的異質(zhì)性。（1）電泳法。早期檢測Lp（a）多采用電泳法。BAUDHUIN等[39]調(diào)查了Lp（a）-C的測量是否不受apo（a）大小的影響，是否可以替代測量Lp（a）的質(zhì)量，他們采用電泳方法分別檢測了進(jìn)行和未進(jìn)行超速離心預(yù)處理的血漿樣本中的Lp（a）-C水平，結(jié)果顯示，未進(jìn)行超速離心預(yù)處理的血漿Lp（a）-C水平與進(jìn)行超速離心預(yù)處理的血漿Lp（a）-C水平高度相關(guān)。因此，可取消超速離心步驟，直接使用電泳法測定Lp（a）-C濃度。但電泳法的靈敏度較差，主要用于定性檢測。（2）免疫透射比濁法。免疫透射比濁法是將血清中的Lp（a）與試劑中的特異性Lp（a）抗體結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生濁度，然后測定波長340 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值得出血液樣本中Lp（a）的水平。該方法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便、精密度高、易于自動化，適用于大批量樣本的檢測；缺點(diǎn)是抗體用量大[是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的數(shù)倍]，對抗體要求高（應(yīng)具有高特異性、高滴度和高親和力），顆粒大小不同的Lp（a）會產(chǎn)生不一致的光散射與光吸收，而且受樣本基質(zhì)的影響較明顯。（3）ELISA。ELISA是早期測定Lp（a）常用的方法，基本原理是用聚苯乙烯微量反應(yīng)板為固相載體，采用apo（a）單克隆抗體包被，加入待測樣本，使其中的apo（a）單克隆抗體與結(jié)合到固相抗體上的apo（a）作用，洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，加入酶的相應(yīng)底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顯色程度取決于結(jié)合在固相載體上的apo（a）的量。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以用抗apo（a）抗體或抗apo B抗體的量代表Lp（a）水平，這也是避免apo（a）分子影響測定結(jié)果的主要方法；缺點(diǎn)是精密度差。為了準(zhǔn)確檢測Lp（a），確認(rèn)其與apo（a）顆粒多態(tài)性無關(guān)，有研究者使用抗apo（a）KⅣ-9型的表面決定簇單克隆抗體，建立了直接結(jié)合的雙單克隆抗體ELISA方法[40]。該方法的詳細(xì)評價(jià)結(jié)果顯示，apo（a）的不均一性不影響測定準(zhǔn)確度。因?yàn)樵搯慰寺】贵w不會與apo（a）分子多變部分的決定簇反應(yīng)，所以可以以摩爾（mol）為單位設(shè)定靶值[40]。（4）超速離心法結(jié)合HPLC。董軍[41]建立了2次超速離心直接分離和測定Lp（a）-C的方法。首先，血清中含有脯氨酸時(shí)，以1.044 kg/L的背景密度超速離心，有>95%的Lp（a）分布在離心管底部；用含巰基乙醇的密度液將底部組分密度調(diào)節(jié)至1.040 kg/L，再次超速離心，使Lp（a）解離，解離后的Lp（a-）分布在頂部，采用HPLC測定頂部組分中的膽固醇即為Lp（a）-C。該方法通過使用巰基乙醇解離Lp（a）及調(diào)節(jié)超速離心的背景密度，大大提高了Lp（a）-C測定的靈敏度和特異性，但超速離心耗時(shí)較久。

5 脂蛋白亞組分和Lp（a）的標(biāo)準(zhǔn)化研究

5.1 脂蛋白亞組分的標(biāo)準(zhǔn)化研究

隨著血清脂蛋白亞組分被認(rèn)為是評估CVD的風(fēng)險(xiǎn)因子，脂蛋白亞組分檢測的標(biāo)準(zhǔn)化顯得極為重要。然而，由于目前國內(nèi)外尚缺乏脂蛋白亞組分測定的正式標(biāo)準(zhǔn)化方案，因此其標(biāo)準(zhǔn)化工作困難重重。脂蛋白亞組分檢測的標(biāo)準(zhǔn)化主要在于標(biāo)準(zhǔn)化方案的制定和實(shí)施、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控材料的制備、檢測方法的合理選擇及測定標(biāo)準(zhǔn)化。我國現(xiàn)已推行的總膽固醇測定標(biāo)準(zhǔn)化以及國家衛(wèi)生健康委老年醫(yī)學(xué)研究所建立的超速離心HPLC測定血清脂蛋白亞類膽固醇的方法可在脂蛋白亞組分測定標(biāo)準(zhǔn)化中發(fā)揮作用。脂蛋白亞組分檢測標(biāo)準(zhǔn)化的難點(diǎn)主要在于脂蛋白各亞組分純品的制備，即缺乏可以長期監(jiān)測脂蛋白亞組分測定的參考物質(zhì)與質(zhì)控材料，僅能通過與其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對來評估檢測結(jié)果的正確度。

5.2 Lp（a）檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究

目前，由于缺乏共同的Lp（a）參考物，不同實(shí)驗(yàn)室之間Lp（a）檢測結(jié)果的差異大，精密度差，無可比性。當(dāng)務(wù)之急是制定可用的二級參考物質(zhì)，使不同分析系統(tǒng)之間和不同實(shí)驗(yàn)室之間的Lp（a）檢測結(jié)果較為接近，或有可比性。

2003年，世界衛(wèi)生組織確定IFCC SRM 2B為Lp（a）免疫測定國際參考物質(zhì)。該參考物質(zhì)瓶內(nèi)Lp（a）的含量為（0.107 1±0.008 6）nmol（分裝時(shí)的不精密度為2.9%），其定值可溯源至美國華盛頓大學(xué)西北脂類研究實(shí)驗(yàn)室的Lp（a）參考檢測系統(tǒng)。IFCC SRM 2B一般作為通用校準(zhǔn)品，用于進(jìn)行一致性檢測調(diào)查前為各個(gè)檢測系統(tǒng)的廠商校準(zhǔn)品定值。

隨著用于測量脂蛋白亞組分和Lp（a）的新方法的引入，標(biāo)準(zhǔn)化變得越來越重要。這些方法是基于不同的原理分離出不同類型的亞組分，因此統(tǒng)一脂蛋白亞組分的定義，即制備參考物質(zhì)和質(zhì)控材料是標(biāo)準(zhǔn)化的第1步。如果要將脂蛋白亞組分和Lp（a）有意義地納入患者的CVD風(fēng)險(xiǎn)評估中，則應(yīng)考慮制定標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃，至少應(yīng)制定用于實(shí)驗(yàn)室間常規(guī)測試結(jié)果比對的測試程序，該程序可以幫助識別和消除方法之間的不一致，保證臨床檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

6 結(jié)語

綜上所述，脂蛋白亞組分常用的檢測技術(shù)主要是VAP、超速離心結(jié)合HPLC、ME和NMR，Lp（a）常用的檢測技術(shù)主要是免疫透射比濁法、ELISA和超速離心結(jié)合HPLC。隨著臨床上越來越多地使用脂蛋白亞組分和Lp（a）作為評估CVD風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)，脂蛋白亞組分和Lp（a）的標(biāo)準(zhǔn)化研究越來越重要。脂蛋白亞組分和Lp（a）標(biāo)準(zhǔn)化方案的建立以及參考物質(zhì)和質(zhì)控材料的制備是實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化最重要的一步。